[发明专利]抑制丙型肝炎病毒复制子复制的抗核酸酶RNA适体

说明书

技术领域

本发明涉及能够抑制丙型肝炎病毒复制子复制的抗核酸酶RNA适体，以及用于诊断丙型肝炎病毒感染的试剂盒和丙型肝炎病毒复制的抑制剂。

背景技术

丙型肝炎病毒(HCV)是引起慢性肝炎、肝硬化以及，在某些情况下，肝细胞癌的主要病原体(参考文献14)。尽管HCV影响超过3％的世界人口，然而目前还没有开发出专门且有效的抗HCV疗法。

HCV包含一条长约9600个核苷酸的正单链RNA基因组，编码多聚蛋白约含3010个氨基酸(参考文献6)。该多聚蛋白前体伴随或翻译后被细胞和病毒蛋白酶加工成至少10个成熟结构蛋白和非结构蛋白(C，E1，E2，p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，和NS5B)(参考文献6和23)。

HCV NS5B具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(参考文献2)，其被认为在HCV基因组复制期间对于负链和病毒基因组RNA的合成是至关重要的。因此，HCV NS5B被认为是病毒增殖必不可少的，因而，是开发抗病毒药物的首要靶(参考文献18)。

RNAs的特征在于它们能够采用复杂而稳定的结构，特异地并且容易地结合目标蛋白，并且可以轻松地化学合成，使RNAs潜在地成为非常有用的诊断和/或治疗先导化合物(参考文献4和8)。

短RNA配体，称为RNA适体，采用被称为指数富集的配体系统进化(SELEX)(参考文献7和28)的体外反复筛选技术，利用高亲和性和特异性结合到多种蛋白，从一个随机RNA文库中鉴别出来。

一些适体已成功地用动物疾病模型进行评估(参考文献9，24和26)，其中一些目前正处于治疗的临床开发阶段(参考文献27)。值得注意的是，美国FDA最近批准了抑制抗血管内皮生长因子(VEGF)的RNA适体，称为哌加他尼钠(Macugen)，用于治疗各种类型的新生血管性老年性黄斑变性(参考文献19)，表明RNA适体巨大的治疗潜力。

最近已经实现专门用于HCV NS5B的高亲和性RNA适体的分离和特征分析(参考文献3和29)。尽管分离出的适体已被证明在体外抑制RNA依赖的RNA聚合酶的酶活性，但没有研究表明用抗HCVNS5B的RNA适体抑制细胞内HCV的复制。

由本发明者进行的深入和透彻的抑制细胞内丙型肝炎病毒复制的研究，导致本发明，结果发现用于HCV NS5B RNA依赖的RNA聚合酶的抗核糖核酸酶RNA适体能够抑制人体肝癌细胞系中HCV的复制。

发明内容

本发明的一个目标是提供一种能够特异性地结合丙型肝炎病毒(HCV)NS5B的RNA适体。

本发明的另一目标是提供一种用于治疗和诊断HCV感染的RNA适体，其能够特异性地结合丙型肝炎病毒NS5B和抑制HCV的复制。

本发明进一步的目标是提供诊断HCV感染的试剂盒和HCV的抑制剂，其使用一种能够特异性地结合HCV NS5B并抑制HCV复制的RNA适体。

根据其中的一个方面，本发明提供一种能够抑制HCV复制子复制的抗核酸酶的RNA适体。

本发明的RNA适体是由至少一个序列组成，选自包含SEQ IDNOS.3和4的组，其中氟基团取代U(尿嘧啶)和C(胞嘧啶)碱基上的2′-羟基，并且SEQ ID NO.4以胆固醇基在5′末端和idT在3′末端标记。在肝细胞内，抗核酸酶RNA适体发挥作用特异性地结合丙型肝炎病毒(HCV)NS5B并抑制HCV复制子的增殖。

来源于RNA适体SEQ ID NOS.1和2的RNA的适体SEQ IDNOS.3和4具有以下序列。

5′-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCUUGAACGAUUGGUAGUAGAAUAUCGUCAGUGAACGGCAGUCAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCU-3′(SEQ ID NO.1)

5′-GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCGACAGGGUAGCUUACAGCUGCAUGAUCGCUAGAGGGCGAACAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCCCCC-3′(SEQ ID NO.2)

5′-GCUGGGCCUUGAACGAUUGGUAGUAGAAUAUCGUCAGUGAACGGC-3′(SEQ ID NO.3)

5′-GUUGAACGAUUGGUAGUAGAAUAUCGUCAG-3′(SEQ IDNO.4)