[发明专利]分离细胞的方法和试剂盒

说明书

相关申请的交叉引用

本申请主张2006年10月6日提交的美国临时申请60/828,537和2007 年3月14日提交的美国临时申请60/894,818的优先权。

关于联邦政府资助研究的声明

不适用

引言

差异提取法(differential extraction)可用于从含有其他类型非靶细胞或主 要由其他类型非靶细胞组成的样品中分离靶细胞物质。优先裂解非靶细胞， 这样可纯化靶细胞，使其与裂解的非靶细胞所释放的非靶物质分离。若靶 物质为下游核酸扩增中待使用或检测的特定细胞类型的核酸，这一方法特 别有用，因为来自非靶细胞的污染核酸会使靶信号模糊不清。由于必须限 制用于核酸扩增的核酸模板的量，该方法特别有助于降低样品模板中非靶 核酸的干扰作用。非靶物质的污染也会干扰其他检测方法，例如酶检测或 基于抗体的靶物质检测。通过在纯化过程中裂解非靶细胞，可降低背景， 从而增加靶物质检测的灵敏性和/或可靠性。

可使用差异提取法的应用实例包括分离法医样品中的精细胞、分离各 种不同材料例如污水、土壤样品、空气样品或体液中可用作生物战剂的生 物以及分离细胞样品中的细胞器。

取自法医样品的遗传物质可用于鉴定性攻击的犯罪者或洗脱无罪疑犯 的罪名。从法医样品中分离的精细胞获得的纯DNA可用于随后的基因相同 性检测。精细胞DNA的基因谱可与已知疑犯的基因谱或与含有大量定罪重 犯遗传信息的数据库进行比较。

在性攻击案件中，从受害者或犯罪现场获得法医样品例如阴道拭子或 直肠拭子或含有精斑的衣物以用于法医分析。如果样品中出现精细胞，可 分离来自精细胞的DNA，用于基因相同性检测。但是，取自性攻击受害者 的阴道拭子一般含有较少的精细胞和来自受害者的大量上皮细胞。因此， 除非首先将精细胞与样品中的其他细胞分离开，从法医样品中纯化的DNA 易受上皮细胞DNA的极大污染。这种污染会干扰样品的DNA的基因谱与 疑犯或数据库成员的基因谱之间建立匹配的能力。因此在分离和分析DNA 前，将精细胞与法医样品中的其他细胞分离开来是理想的。

目前用于将精细胞与法医样品中其他细胞分离的技术耗时费力，因此 目前积压了许多未处理样品。由于未处理样品积压过多，一些司法部门采 取了除非已确认疑犯否则不予处理样品的政策。结果，许多未处理样品最 终被丢弃，而样品所含的遗传信息却从未与国家数据库比较过或被录入到 国家数据库，因而降低了鉴定和震慑性犯罪惯犯的执法能力。

一般通过蛋白酶K和去污剂在非还原性条件下处理含有上皮细胞的法 医样品，选择性裂解上皮细胞，从而分离出法医样品中的精细胞。上皮细 胞裂解后，离心沉淀下完整的精细胞，并除去含有裂解上皮细胞DNA的上 清。为了最大程度降低可溶的上皮细胞DNA的污染，使用含水缓冲液反复 洗涤精细胞沉淀，以除去可溶的上皮细胞DNA。该过程通常导致精细胞损 失，且极为费力。

通过将精细胞选择性结合到固相载体(例如顺磁颗粒)上的精细胞特异 性多克隆抗体或单克隆抗体，已从同时含有精细胞和上皮细胞的样品中分 离出精细胞。细胞结合到固定化抗体上后，洗涤载体以除去未结合的细胞。 该方法需要大量抗体，因此相对较贵。而且结合过程效率低，一般在洗涤 步骤中会损失精细胞，从而导致收率和敏感性降低。由于精细胞在阴道较 低的pH下发生了结构变化，许多精细胞特异性的抗体并不结合来自所有含 有精液的样品的精细胞。此外，由于某些个体精细胞表面抗原发生变异或 突变，抗体可能无法有效地结合，因而导致精细胞的低收率。

根据细胞尺寸的差异，通过在尺寸选择性滤膜上过滤样品，可分离出 上皮细胞中的精细胞。由于精细胞容易被困在上皮细胞、粘液和细胞碎片 之间，使得精细胞形成过大的团块难以通过滤膜，而且滤膜容易发生堵塞， 最终可导致精细胞的低收率，因此该方法存在问题。此外，来自裂解的上 皮细胞的DNA与精子一同通过滤膜，因而会污染精子。

在另一种方法中，通过首先选择性裂解上皮细胞，随后过滤裂解液， 以将可溶的上皮细胞DNA和完整精细胞分离开，从而分离精细胞。但是， 该方法也有缺点，其中包括滤膜堵塞，它会导致精细胞被上皮细胞的DNA 污染。