[发明专利]合成和纯化寡核苷酸的化合物和方法

说明书

发明领域

本发明涉及核酸化学和分子生物学。更具体地说，除了化学封端试 剂和包含这种试剂的组合物、试剂盒和系统之外，本发明还提供了合成 和纯化核酸的方法。本发明可以用于各种工业、医学和司法鉴定目的。

发明背景

本发明涉及合成和纯化寡核苷酸的新化合物和方法，更具体地说， 涉及合成、化学封端和纯化核苷酸的化合物和方法。在生命世界中，核 苷酸作为遗传信息的载体和传递者是至关重要的。由于F.Miescher发现 了它们，它们引起了广泛的科学兴趣，这导致人们开始阐明它们的功能、 结构和作用机理。核苷酸序列的变化常常是由于对疾病和对治疗时的药 理学应答的敏感性的差别所造成的。举例来说，核苷酸分子的单个碱基 的变化(通常称为单个核苷酸多态性(SNPs))，可以影响个体患指定疾 病的危险性。通过比较这些变化，研究人员获得了对SNPs的医学应用 性的理解，由此提高我们有效确诊、预知和治疗疾病的能力。此外，纯 化的合成核苷酸用于扩增聚合酶链式反应(PCR)及其它扩增方法；作为 引物；检测和/或排序、基因治疗、克隆、位点特异性突变研究等等的杂 交探针。这些技术结果的质量直接与所使用的寡核苷酸纯度相关。

因此，为了阐明这些分子的功能和便于这些分子的操作，核苷酸分 子的纯度是关键的。对于短寡核苷酸的制备，自动的固相合成是最普通 方法。这些合成方法通常基于亚磷酰胺或核苷的氢膦酸酯衍生物的逐步 反应、以预先确定的顺序形成这些单体结构单元的连续连接基(参见例 如，T.Brown & D.J.S.Brown，Oligonucleotides and Analogues--A Practical Approach，(1991)(Eckstein，F.，publ.IRL Press at Oxford University Press，Oxford，N.Y.，Tokyo)；Sambrook等人，1989，Molecular Cloning--A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait，ed.， 1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984)； Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry，Beaucage，S.L.；Bergstrom， D.E.；Glick，G.D.；Jones，R.A.，Eds.，John Wiley & Sons，Inc.：New York， Chapters 1-4，2000-2004；和一系列，酶学方法(Academic Press，Inc.)。然 而，得到的寡核苷酸是非均匀排序混合物，其使得纯化变复杂，并且限 制了制备寡核苷酸的规模和得到的产率。随着链长度的增加，进一步加 大了纯化难题。典型地，得到的未反应的5′-羟基在化学上用乙酸酐封端， 从而防止进一步的、具有错误“失效”序列的链延长。可以平行进行的 另一种方法是所谓的基于三苯甲基的纯化(TOP)，其利用三苯甲基保护 基的亲油性。所需要的、携带亲脂性的三苯甲基的序列保留在亲脂性的 载体物质上，而将没有三苯甲基的失效序列除去。三苯甲基在酸性条件 下裂解之后，可以从亲脂性载体上洗脱所需要序列的产物。

可以使用各种方法纯化寡核苷酸，例如上述的反相层析、阴离子交 换(AX)色谱、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、乙醇沉淀或这些技术的联用。 然而，由于在寡核苷酸合成中酰基和三苯甲基对于所使用的条件相对不 稳定(例如典型的寡核苷酸脱保护条件包括在氨水中、在55-60℃培养16 小时)，导致不良的纯化或低产率，所以这些方法具有缺点。由于疏水作 用不是特别强烈，因此分离效率随着链长增加而快速降低。造成这些方 法受到限制，因而，这些方法限于制备小于100个核苷酸的核苷酸，同 时所需要的序列的产率低。