[发明专利]抗微生物肽作为对虾中细菌感染抗性标志物的用途

说明书

本发明涉及编码抗微生物肽之基因的转录物作为对虾对细菌感染之抗 性的标志物的用途。

对虾的水产养殖涉及热带、亚热带和温带的许多国家。主要使用了9 种对虾：凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei，太平洋白虾)，这是最广泛 使用的品种；细角滨对虾(L.stylirostris，太平洋蓝虾)；来自大西洋的三 个品种，包括白滨对虾(L.setiferus，大西洋白虾)、南方滨对虾(L.schmitti， 南方白虾)和保罗美对虾(Farfanpenaeus paulensis，圣保罗虾)；以及短 沟对虾(Penaeus semisulcatus，绿虎虾)、斑节对虾(P.monodon，黑虎虾)、 中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis，肉虾)和日本囊对虾 (Marsupenaeus japonicus，车虾(Kuruma prawn))。

在其水产养殖中的一个主要问题是由感染性疾病引起的，主要是病毒 或细菌来源的感染性疾病。

就细菌致病性而言，已描述的主要感染原属于弧菌科(Vibrionaceae) (VANDENBERGHE等，Appl.Environ.Microbiol.，65：2592-7，1999)。尽 管弧菌一般被认为是共栖或共生的细菌，但许多菌种在某些环境条件下也 可能对虾产生致病性。在研究最广泛的菌种中，值得一提的是对虾弧菌 (Vibrio penaeicida)，它对幼虫、幼虾和成年虾均有致病性，并且是虾的 弧菌感染模型中最普遍使用的。

此外，这种致病性弧菌是与名为“综合征93”的循环致死相关的主要 病因，该病出现于1993年，其在生长期影响了新喀里多尼亚孵化场 (MERMOUD等，Aquaculture，323-335，1998)。

已经广泛使用抗生素作为预防剂和治疗剂来处理孵化场水域中的动 物。由于出现了抗性细菌，也由于抗生素可能导致环境失衡，因此其应用 目前已出现了问题。

人们已提出了新的预防方法来控制疾病，例如使用会对孵化场中的动 物存活及生长具有有益效果的益生菌，或者使用免疫刺激剂，例如来自酵 母或来自细菌的β-葡聚糖或多糖。

因为缺乏记忆性的免疫系统，所以不可能将脊椎动物中使用的免疫接 种法用于甲壳动物中。在甲壳动物中，针对感染的防御是基于先天免疫应 答，其主要参与者是血细胞，特别地，它们产生多种抗微生物肽。

在对虾中，迄今最为熟知的抗微生物肽属于对虾素(penaeidin)家族 (BACHERE等，Immunol.，Rev.，198：149-68，2004)。目前已鉴定的对虾 素被分为三个亚类，分别称为PEN2、PEN3和PEN4(GUEGUEN等，Dev. Comp.Immunol.，30：283-8，2006)，PEN3亚类就数量而言是最有代表性 的。

在虾中还鉴定出了其他抗微生物多肽。例如，值得一提的是在斑节对 虾血细胞cDNA文库中鉴定到的鲎抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor，ALF)同源物(SOMBOONWIWAT等，Dev.Comp.Immunol.，29： 841-51，2005)，以及在多个对虾品种的EST中鉴定到的溶菌酶同源物和 11.5kDa抗微生物蛋白(称为crustin)同源物(GROSS等，Dev.Comp. Immunol.，25：565-77，2001；SUPUNGUL等，Mar.Biotechnol.(NY)，4： 487-94，2002)。

在对虾中，在应答于非致病性物质刺激后或在致病细菌感染过程中对 血细胞群的研究以及对对虾素表达的研究(MUNOZ等，Eur.J.Biochem.， 269：2678-89，2002；MUNOZ等，Cell Mol.Life Sci.，61：961-72，2004； DESTOUMIEUX等，J.Cell Sci.，113(Pt 3)：461-9，2000)使得有可能更好地 理解该免疫应答的机制。

对虾对细菌感染之免疫应答的第一阶段(对应于感染后的最初6或12 个小时)的特征为循环血细胞总数减少，以及对虾素相对表达降低。这种 降低反映出血细胞向感染部位迁移并在此处裂解及释放对虾素。

此第一阶段之后，在感染后24至48小时回复至基础水平。