[发明专利]用于数字多重PCR测定的装置和方法

说明书

本申请要求2006年11月29日提交的临时专利申请系列号60/867,459的优先权，其通过引用合并入本文。

发明背景

发明领域

本发明涉及使用连续流式多重测定的方法，更具体地，使用其中将结果转换成数字格式的连续流式多重测定的方法。可对多个患者样品中的每一个样品进行多重测定，从而允许高水平的复用性(multiplexing)和灵活性。

相关技术的论述

目前，多重聚合酶链式反应(“PCR”)以静态形式进行，其中各反应在分开的试管、毛细管或多孔板的孔中完成。在所有情况下，可进行的PCR反应的数目受到固定形式中的位置的数目限制。最常见地，使用可允许例如一个待测试患者DNA样品进行达到96个不同PCR测定的96孔格式。在该格式中，可增加被检测的患者DNA样品的数目，但以减少可进行的不同PCR测定的数目为代价。例如，在96孔格式中，可检测24个不同的患者DNA样品，但只能进行4个PCR测定。更近以来，已引入384孔板格式，其增加了可进行的患者-测定组合的数目，但是如果需要进行100个不同的PCR测定，即使该格式也不能容纳超过3个患者的DNA样品。

允许询问(interrogation)数千个基因座的DNA微阵列是对基于板的测定的限制的另一选择，但至关重要的不利方面是对输出数据的可靠性的限制、进行此类测定所需的高昂的费用和长时间以及微阵列是不允许最终用户按需要改变测定的固定格式。

许多诊断患者的疾病状态、诊断发生疾病的风险或预测患者对不同治疗性药物的反应的新型诊断PCR测定关注于鉴定单核苷酸多态性(SNP)。在大多数情况下，多个SNP的确定是精确诊断或预测治疗反应所必需的。绘制人基因组中的所有SNP图谱的努力不断地增加与特定疾病状态或治疗结果关联的SNP的数目。同时进行数十个测定的多重分析是许多诊断和治疗预测应用所必需的。目前存在对允许高复用性和灵活性格式以容纳新靶(当需要时)的PCR测定格式的未满足的需要。

热解链分析(thermal melting analysis)目前在本领域中用于在基于PCR的测定中区分SNP。Wittwer已公开了利用荧光分子测定核酸的热解链特征和基于热解链特征区分SNP的方法和装置。(参见美国专利6,174,670、6,140,054、6,472,156、6,753,141、6,569,627和美国专利申请公开号2003-0224434A1和2005-0233335A1)。然而，这些方法和装置遭受上述相同的限制。

发明概述

本文中描述的发明使得热解链分析能够用于在连续流式PCR微流控芯片(microfluidic chip)中进行的SNP检测，从而产生多重检测的数字输出。

连续流动格式允许单独地和分别地监控多重PCR+热解链测定(Thermal Melt assay)的单个PCR反应和热解链，而不影响多重测定中的其他PCR反应和热解链。连续流动格式允许比96和384孔格式程度更高的复用性，其是复杂的遗传药理学测定(pharmocogeneticassay)所必需的。连续流动格式比静态的、固定的格式更灵活。此外，用户可规定使用的测定数目和进行它们的顺序。数字输出(例如，指定阳性结果为“1”和阴性结果为“0”或反之亦然)简化了结果的解释并且允许容易地将数据传递至数字媒介。

本发明的方面体现在使用包含多个反应通道的微流控芯片对多个样品进行多重测定的方法。该方法包括步骤：在多个反应通道的每一个中提供连续的样品流并且交替地向每一个通道导入一定量的试剂材料和缓冲材料，从而沿着各通道的一部分长度形成包含与载体液(carrier fluid)顺序交替的受试溶液团的连续流。受试溶液包含样品与试剂材料的混合物，而载体液包含样品和缓冲材料的混合物。对各通道内的连续流进行扩增方法，然后在进行扩增方法后检测由各受试材料团发出的信号。分析被检测的信号以确定目的核苷酸在样品材料团内的存在或不存在。通过将结果指定为1或0将分析步骤的结果转换成数字格式，其中表明目的核苷酸存在的结果被指定为1，表明目的核苷酸不存在的结果被指定为0或反之亦然。