[发明专利]骨髓细胞用于长期培养胰腺胰岛细胞的用途

说明书

相关申请的参考

本申请要求保护2006年11月21日申请的美国临时专利申请序号60/860,637的优先权，该临时专利申请整体在此引入作为参考。

关于联邦支持研究的声明

本发明经国立卫生研究所(NIH)资助号P20RR018757得到美国政府支持。因此，美国政府拥有本发明的一定权益。

发明领域

本发明一般来说涉及胰岛细胞培养领域。更具体地说，本发明涉及骨髓细胞用于在移植前长期培养并可能扩增胰岛细胞的用途。本发明还包括在骨髓细胞存在下培养的胰岛细胞在患者中体内替代人胰岛功能的用途。

发明背景

糖尿病是一个重大且病例不断增长的全球性健康问题[1]。基于标准胰岛素的治疗方案尽管管理血糖水平，但不是治愈性的，患者仍遭受该病的许多长期并发症[2，3]。胰腺移植可治愈该病，但受限于组织可获得性和对免疫抑制疗法的响应[4]。为了保持胰岛细胞的存活力，需要由供体相对快速地收集胰腺。标准移植免疫抑制方案对胰腺移植物并非总是有效。而且，免疫抑制疗法可导致对肾脏的进一步伤害，这常常使需要胰腺移植的患者的功能受损。或者，胰岛β细胞移植可能有效，且几乎不需要猛烈的免疫抑制方案；然而，胰岛细胞的可用性不如胰腺[5]。一次成功的胰岛细胞移植经常需要由2个或3个供体收集细胞，这进一步限制了可通过该方法治疗的个体的数目。分离用于移植的胰岛β细胞也是重要的。

在胰岛的分离、储存和运输过程中经历的事件与导致胰岛功能丧失并限制胰岛移植对糖尿病患者的治疗潜力的细胞死亡相关。采用β细胞胰岛移植方案的关键问题涉及在体外或体内难以保持存活的胰岛以及不能通过体外培养扩增胰岛组织。研究已表明，在由供体收获胰腺后尽快进行的由胰腺收获之间没有培养细胞时，胰岛细胞移植是最成功的。不出意料的是，在进行大部分移植的中心的移植也是最成功的。由于这种强有力的培养环境的缺乏，所以用于胰岛细胞移植的供体必须在组织收获时邻近较大的移植中心，受体必须生活在较大的移植中心附近，经常长时间等待一个以上的供体。

发明概述

本发明包括持续维持培养中的胰岛β细胞存活力、结构和/或功能的方法。所述方法包括将胰岛β细胞与骨髓细胞一起培养。发现骨髓细胞在降低炎性细胞因子释放和凋亡的同时，促进胰岛β细胞的生长和存活力，并改善β胰岛细胞的功能和形态。已表明胰岛细胞保持胰岛β细胞功能，这通过基础和诱导的胰岛素释放证实。脐血细胞和分离的外周CD34+血细胞不能支持β胰岛细胞生长或增加存活。

本发明包括将胰岛β细胞与多种骨髓细胞一起培养以扩增培养的胰岛β细胞的方法，其包括降低共培养的凋亡的方法。发现骨髓细胞至少部分通过减少凋亡促进胰岛β细胞生长，也通过增加胰岛β细胞数促进胰岛β细胞生长。扩增胰岛细胞的能力是降低单个受体需要多个供体所必需的，从而潜在地允许广泛应用胰岛β细胞移植。

本发明包括将胰岛β细胞与多种骨髓细胞一起培养以促进培养中的胰岛聚集的方法。骨髓细胞刺激胰岛聚集的过程。

本发明进一步包括降低培养胰岛β细胞的细胞因子和其它炎性调节物的释放的方法。所述方法包括将胰岛β细胞与骨髓细胞一起培养。与没有骨髓细胞时培养的胰岛β细胞相比，胰岛β细胞与骨髓细胞的共培养降低炎性细胞因子如白介素(IL)-1β的释放。这可能导致患者响应于胰岛β细胞移植的炎性反应下降。

本发明包括将胰岛β细胞与多种骨髓细胞一起培养以增加内分泌细胞特异性基因(包括胰腺特异性转录因子)的基因表达的方法。所述因子包括内分泌细胞特异性基因GCG(胰高血糖素，α-细胞基因)、INS(胰岛素，β-细胞基因)和SST(促生长素抑制素，γ-细胞基因)；以及β细胞胰腺和十二指肠同源框1转录因子(PDX1或IPF1)、神经元素3(NGN3)、成对盒基因6(PAX6)、胰岛-1(ISL1)、v-maf肌肉腱膜纤维肉瘤癌基因同源物A(MAFa)和Mist 1。所述方法包括将胰岛β细胞与骨髓细胞一起培养。所述方法进一步包括增加NGN3的表达，以增加β细胞再生。所述方法进一步包括通过增加PDX1、IPF1、NGN3、PAX6、ISL1和MAFa中至少一种的表达促进β细胞的长期存活。所述方法还包括通过增加Mist1的表达促进新胰腺组织组织化的方法。