[发明专利]使用不需要钙黏着蛋白受体的毒素遏制昆虫对苏云金芽孢杆菌CRY毒素的抗性

说明书

发明概述

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，Bt)的Cry毒素由于它们在控制不 同栽培品种、林木中的虫害和在人类中传播疾病的昆虫的能力而具有重要价 值。昆虫侵袭对Bt毒素抗性的产生是继续成功使用此环境友好的杀虫剂的主 要障碍。昆虫中对Cry毒素抗性的主要机制包括Cry毒素与位于昆虫肠道的 特异性受体的结合降低(Ferré和Van Rie，2002)。

Cry1A蛋白质是杀死一些重要鳞翅目昆虫的一组Bt毒素。在三种主要 的棉花害虫品系中[烟芽夜蛾(Heliothis virescens)(Gahan等人，2001)、红铃麦 蛾(Pectinophora gossypiella)(Morin等人，2003)和棉铃虫(Helicoverpa armígera) (Xu等人，2005)]，对Cry1A毒素的抗性与钙黏着蛋白的变化有关，钙黏着 蛋白担当易感昆虫的肠中Cry毒素的初级受体(primary receptor)。钙黏着蛋白 基因的突变产生对Bt毒素的“1型”抗性，这种类型的抗性是不同昆虫中出 现频率最高的抗性。这种类型的抗性呈现对至少一种Cry1A毒素的高水平抗 性，其本质是隐性的，它降低至少一种Cry1A毒素与抗性昆虫的膜的结合并 呈现非常小的对毒素Cry1C的交叉抗性(Ferré和Van Rie，2002)。令人感兴 趣的是，小菜蛾(gusano dorso de diamante，DBM)，Plutella xylostella，攻击蔬 菜诸如西兰花(brócoli)和花椰菜的一种世界范围的害虫，呈现对Cry1A毒素 的“1型”抗性，但是在这种情况下它并不与钙黏着蛋白基因中的突变直接 相关。DBM是田间选择的世界上唯一的Bt毒素抗性昆虫(Tabashnik，2004)。 与钙黏着蛋白的结合促进了结构域I的α-1螺旋的蛋白水解切割和负责这些 蛋白质的毒性的寡聚体前孔(pre-poro)的形成(Gómez等人，2002)。

在本发明中，证明了从缺少编码螺旋α-1的DNA的3-结构域Cry基因 构建体(construcciones)产生的修饰的3-结构域Cry毒素，杀死对野生型 (silvestres)3-结构域Cry毒素(未修饰的Cry毒素)具有抗性的昆虫。

昆虫对未修饰的3-结构域Cry毒素的抗性的遗传基础与编码Cry1A毒素 初级受体的钙黏着蛋白基因中的突变有关。在抗性昆虫中，所述初级受体被 截短或不存在，所以Cry毒素与肠细胞膜的结合被降低或不存在。因此，抗 性昆虫对未修饰的3-结构域Cry毒素不敏感。本发明中介绍的修饰的3-结构 域Cry毒素通过不需要毒素与钙黏着蛋白受体的结合来遏制抗性。修饰的3- 结构域Cry毒素的毒性得到了对野生型Cry1A毒素具有抗性的两种昆虫品系 的证明，其还在通过沉默钙黏着蛋白RNA诱导的对Cry毒素的具有降低的 易感性的昆虫中进行了测试。一个抗性昆虫品系通过钙黏着蛋白基因的遗传 修饰呈现1型抗性，而另一品系则呈现与钙黏着蛋白基因中的突变无关的1 型抗性。

通过构建缺少α-1螺旋的基因产生的修饰的Cry1A蛋白质诱导寡聚体前 孔的体外(in vitro)形成而不需要结合钙黏着蛋白受体，也不需要含有Cry毒素 结合位点的钙黏着蛋白的片段或scFv格式的抗体(scFv73)(其模拟钙黏着蛋 白受体中存在的Cry毒素结合区)(Gómez等人，2002)。另一方面，未修饰 的Cry1A蛋白质需要scFv73抗体或钙黏着蛋白的片段或钙黏着蛋白的存在 以体外产生寡聚体前孔。