[发明专利]快速检测猪伪狂犬抗体的试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测动物疾病的试纸条，尤其涉及一种快速检测猪伪狂犬病毒抗体的试纸条，本发明还涉及该试纸条的制备方法和应用方法，属于动物疾病检验检疫领域。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪疱疹病毒I型引起的一种高度传染性、致死性传染病。猪是该病最主要的贮存宿主和传染源，健康猪与病猪、带毒猪直接接触可感染本病。成年猪常为隐性感染；  怀孕母猪发生流产、死胎、弱胎、木乃伊胎；新生仔猪出现发热及神经症状，甚至衰竭死亡，死亡率可达100％。近年来，该病不断传播蔓延，给养猪业造成巨大的经济损失。

目前，公知的猪伪狂犬抗体快速检测试剂盒(ELISA法)，系采用酶联免疫技术检测样品(血清)中猪伪狂犬抗体的方法。即：采用猪伪狂犬灭活弱毒或弱毒疫苗株经纯化、浓缩制成的抗原包被微孔板，在试验中，加入稀释的对照血清和待检血清，经温育后，若样品中含有猪伪狂犬特异性抗体，则将与微孔板上抗原结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后；再加入酶标二抗，与微孔板上抗原抗体复合物发生特异性结合；再经洗涤除去未结合的酶结合物，在孔中加TMB或OPD底物液，与酶反应形成有色产物，加入终止液反应后，用酶标仪固定波长(450nm或630nm)测定各反应孔中的OD值。ELISA适合大批样品的检测，成为了一种常规的检测方法。但是，该方法抗原的制备过程必须经过病毒的细胞培养、病毒纯化等繁琐模式，特异性不高、稳定性差，而且成本高；检测时需要专门的仪器设备如酶标仪来配合使用，检测操作人员需要经过专业培训；操作过程相对比较复杂；检测所需要时间比较长；检测所需费用高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的问题，提供一种能够快速检测猪伪狂犬病毒抗体的试纸条，该试纸条不需要专业的技术人员进行操作，方法简便易学，不用任何仪器进行辅助检测，检测结果特异性高，重复性好。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种快速检测猪伪狂犬病毒抗体的试纸条，包括由样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜(NCM)、吸水垫和支持物组成；所述的硝酸纤维素膜含有一条由猪伪狂犬gE蛋白包被而成的检测线和由兔抗猪伪狂犬抗体包被而成的对照线；所述的玻璃纤维膜结合由胶体金标记的猪伪狂犬gE蛋白；玻璃纤维膜、硝酸纤维膜和吸水垫按照以下次序相连接并附着在支持物上：玻璃纤维膜与靠近硝酸纤维膜检测线的一端相连接，吸水垫与靠近硝酸纤维膜对照线的一端相连接；样品垫附着在玻璃纤维膜上，样品垫的一端与硝酸纤维素膜相衔接。

其中，所述的支持物只要具有一定的硬度，将样品垫、玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜和吸水垫负载于其上，达到支持和负载的目的即可，可以选用各种材料作为本发明的支持物，例如塑料板(优选为PVC)、硬纸板、铝板等。

所述的猪伪狂犬gE蛋白可按照常规的基因工程方法进行制备或表达，这些方法都是本领域技术人员所能掌握或通晓的。

所述的兔抗猪伪狂犬抗体可参考以下方法制备得到：用猪伪狂犬弱毒抗原采用多点注射法免疫阴性家兔3只，每隔2周加强免疫1次，共进行3次，最后一次免疫10天后采血，分离血清，纯化后得兔抗猪伪狂犬IgG。

所述硝酸纤维素膜(该硝酸纤维素膜也可由尼龙膜来替换)上的检测线和对照线之间的间隔优选为3-5mm，更优选为4mm。

一种制备本发明的检测猪伪狂犬抗体的试纸条的方法，包括：

(1)用喷膜机将胶体金标记的猪伪狂犬gE蛋白复合物喷涂在玻璃纤维膜上，备用；

(2)将猪伪狂犬gE蛋白和兔抗猪伪狂犬抗体IgG依次间隔3-5mm喷在硝酸纤维膜上，分别作为检测线和对照线，将包被好的硝酸纤维膜封闭其余蛋白结合位点，洗涤，干燥，备用；

(3)将硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、样品垫、吸水垫按照以下次序粘在支持板上：将玻璃纤维膜连接在靠近硝酸纤维膜检测线的一端，边缘附着在硝酸纤维素膜上；样品垫附着在玻璃纤维膜上，与硝酸纤维素膜衔接；吸水滤纸板连接在硝酸纤维素膜的另一端，边缘附着在硝酸纤维素膜上；

(4)将粘好的支持板材料切成60mm长、4mm宽的试纸条，即得。

本发明试纸条的检测方法：

1操作方法：在检测前先将样本和试纸条放在室温条件下放置一段时间(10分钟)，使其恢复至室温；从铝箔袋中取出检测试纸条；在椭圆形加样孔内加入3-5滴(100-200μl)待检猪血液或血清样品；将试纸条平放在桌面上，在室温下静置20分钟判定结果；

2结果判断：

无效：在对照线和检测线都不出现色线；