[发明专利]结缕草中胁迫诱导型启动子Rd29A的克隆和功能鉴定

说明书

技术领域

本发明属植物生物技术领域或作物育种领域。具体说，涉及结缕草DNA的提取、引物设计、基因克 隆和载体构建、基因枪转化的相关技术。从而从结缕草中获得了胁迫诱导型启动子Rd29A，并对其功能 进行了鉴定。

背景技术

干旱、高盐及低温胁迫都会使植物缺水受伤害，严重时导致植物死亡。为了适应或抵抗这些不利的 环境状况，植物会做出各种反应来维持本身的水分状况，以避免或减轻缺水对细胞的危害，目前对这方 面的研究，重点集中在植物缺水引发的分子反应和信号传递。根据近年来的报道，许多植物基因的表达 受上述干旱、高盐及低温胁迫的诱导。Rd29A基因编码一种与LEA蛋白相似的亲水性很强的蛋白，该 基因的表达受到干旱、低温和高盐的诱导。Rd29A基因启动子是一个受干旱、盐碱的逆境诱导表达的特 异性启动子，该启动子区域中，有两个与上述环境胁迫应答有关的DRE顺式作用元件，DREB转录因子 和DRE元件在干旱、高盐及低温胁迫信号转递中起重要作用。

结缕草(ZoysiaJaponicaSteud.)是我国资源丰富的唯一不需要进口的草坪草种，具有适应性强，长势 旺盛，喜光、抗旱、抗热和耐贫瘠，抗寒性在暖地型草坪草中表现得较突出，在微碱性土壤中亦能正常 生长的特性。本发明从结缕草中克隆出胁迫诱导型启动子Rd29A，并对其功能进行了鉴定，为下一步用 此启动子调控逆境胁迫诱导基因的表达，提高转基因草坪草抗逆性奠定基础。

发明内容

本发明以中国野生结缕草为材料，利用PCR方法获得了胁迫诱导型启动子Rd29A的序列，在GenBank 上的登录号是：EU346948。以表达载体pBI121为基础，GFP(绿色荧光蛋白)为报告基因，构建了用 于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG(35S-GFP)和pBIRG(Rd29A-GFP)两个植物真核表达载体。采用基 因枪法对洋葱表皮细胞进行转化，检测Rd29A启动子在受体细胞中调控GFP基因表达的活性，从而对 其功能进行鉴定。

本发明的主要步骤包括：以结缕草为植物材料，提取植物总DNA，利用生物软件设计一对特异引 物，经过PCR扩增方法获得了Rd29A启动子序列，并以pBI121为基础，分别构建了pBIG(35S-GFP)和 pBIRG(Rd29A-GFP)两个植物真核表达载体。采用基因枪法对洋葱表皮细胞进行转化，检测Rd29A启动 子在受体细胞中调控GFP基因表达的活性。

附图说明

图1结缕草总DNA的电泳图；图2扩增到的Rd29A启动子片段电泳图；图3结缕草胁迫诱导型 启动子Rd29A的核苷酸序列；图4pBIG和pBIRG两个植物表达载体的构建图；图5pBIRG表达载体中 GFP酶切检测电泳图；图6pBIRG表达载体中Rd29A酶切检测电泳图；图7pBIRG表达载体中GFP的 PCR检测电泳图；图8pBIRG表达载体中Rd29A的PCR检测电泳图；图925℃下35S驱动GFP基因在 洋葱表皮中的表达；图1025℃下Rd29A驱动GFP基因在洋葱表皮中的表达；图114℃下Rd29A驱动 GFP基因在洋葱表皮中的表达；图124℃下35S驱动GFP基因在洋葱表皮中的表达。

具体实施方式

1材料与方法

1.1植物材料

结缕草的标本由北京林业大学草坪研究所采集并保存，采集于辽宁省辽阳县鸭子沟。

1.2实验方法

1.2.1结缕草基因组DNA与大肠杆菌质粒DNA提取

结缕草基因组DNA的提取采用SDS法(附图1)，大肠杆菌质粒DNA的提取和相关操作采用碱裂解法 (具体实验操作步骤参考分子克隆实验手册)。

1.2.2Rd29A启动子目的基因克隆

根据已报道的Rd29A启动子基因序列，经分子生物学软件Oligo分析，设计了以下两对引物，同时引入 了便于载体构建过程中进行定向连接的相应酶切位点BamHI和HindIII。

P 1：5′-CTGCAAGAATCTCAAACACG-3′，P2：5′-TCCAATAGAAGTAATCAAACC-3′

以结缕草基因组DNA为模板，用P1和P2为引物，进行PCR扩增，扩增参数为：95℃5min，94℃30s， 57℃40s，72℃90s，30个循环，72℃延伸10min，循环结束后在4℃保存，进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。