[发明专利]检测基因突变的方法

说明书

发明背景

本发明涉及一种检测基因插入和缺失突变的方法。

近年来，检测遗传多态性的技术发展迅速。利用固定在底物上的探针的方法就是这些技术中的一种。在该方法中，通过与探针杂交来检测靶标核酸。

遗传多态性除单碱基置换之外，还包括插入突变、缺失突变等等。关于用上述方法检测单碱基置换的报道已有许多。然而，关于用上述方法检测插入突变和缺失突变的报道却几乎没有(参见，例如，Nat Genet.14，441-7，1996和Nucleic Acid Res.33e33，2005)。

当用探针检测插入突变或缺失突变的时候，探针与靶标核酸的杂交可能发生突变位点被环状突出，因而出现非特异杂交。这引起了突变不能被准确检测的问题。所以需要发展出一种检测方法，该方法使用固定化探针能够精确检测插入突变和缺失突变。

发明简述

本发明的一个目的是提供检测基因突变的方法，所述方法通过使用探针能精确检测插入突变和缺失突变。

根据本发明的一个方面，它提供了检测基因插入突变的方法，其包括步骤为：使靶标核酸与野生型探针和突变型探针反应，检测结合到各个探针上的靶标核酸的量，和将结合野生型探针的靶标核酸的量与结合突变型探针的靶标核酸的量相比较。

附图简述

图1A是插入突变型靶标核酸与探针反应的示意图。

图1B是当突变位于中心之外时，插入突变型靶标核酸与探针反应的示意图。

图2A是野生型靶标核酸与野生型探针反应的示意图。

图2B是插入突变型靶标核酸与野生型探针反应的示意图。

图2C是野生型靶标核酸与突变型探针反应的示意图。

图2D是插入突变型靶标核酸与突变型探针反应的示意图。

图3A是野生型靶标核酸与野生型探针反应的示意图。

图3B是缺失突变型靶标核酸与野生型探针反应的示意图。

图3C是野生型靶标核酸与突变型探针反应的示意图。

图3D是缺失突变型靶标核酸与突变型探针反应的示意图。

图4是显示LAMP方法中所用引物位置的示意图。

图5显示CYP2D6基因的序列。

图6是CYP2D6＊18与野生型探针之间反应的示意图。

图7是CYP2D6与突变型探针之间反应的示意图。

图8A显示用每一探针检测CYP2D6的结果。

图8B显示用每一探针检测CYP2D6＊18的结果。

发明详述

本发明提供了检测基因插入和缺失突变的方法。根据本发明，可以确定目的基因是否为野生型或者突变型。此处所用的术语“野生型”表示高频率出现的基因型，而此处所用的术语“突变型”表示低频率出现的基因型。在本文中，作为检测对象的核酸被称作靶标核酸。其序列与野生型靶标核酸互补的探针被称作野生型探针，而其序列与突变型靶标核酸互补的探针被称作突变型探针。

常规方法中所用的探针，其突变位置在探针中心附近。例如，在NatGenet.14，441-7，1996.中，使用了20个碱基的探针，并且有一个突变位点位于从该探针3’端起第九个碱基处。在Nucleic Acid Res.33e33，2005.中，使用了25个碱基的探针，有一个突变位点定位于从该探针3’端起的第十三个碱基处。

然而，当突变位点定位在探针中心附近时，不管靶标核酸中存在或不存在突变，所述探针都将结合靶标核酸。示意图显示在图1A中。图1A显示插入突变型靶标核酸21与野生型探针10之间的反应。因为它们的序列彼此不互补，突变型靶标核酸21原本是不会结合野生型探针10。然而，如图1A所示，靶标核酸21会结合探针10，而其插入突变位点被环状突出。其中，从探针10的一端到突变位点和从探针10的另一端到突变位点的链长是大致相等的，因而使得两侧都稳定结合。结果，尽管靶标核酸21是突变型，其仍结合野生型探针10导致测定错误。在靶标核酸有缺失突变的情况下，另一方面，野生型探针可以稳定结合其靶标核酸，同时对应于靶标突变位点的位点被环状突出。

由此推断如本发明所示，突变位点可以定位于探针中心的外侧以减少非特异的结合。如图1B所示，当突变定位在探针11中心外侧时，从探针一端到突变位点的区域将短于另一区域。因而，较短区域的结合将不稳定，从而让这段区域容易从靶标核酸22上分离开来。能够由此减少非特异的结合。根据本发明，通过使用突变位点位置适当的探针，能够提高检测准确性。

可以通过例如用解链温度(Tm)来确定适合的探针如下：

首先，对用于检测插入突变的探针进行描述。