[发明专利]构建表达预定糖链修饰糖蛋白工程菌株的方法

权利要求书

1.一种构建表达预定糖链修饰糖蛋白工程菌株的方法，该方法包括下列步骤：

a)以编码糖苷酶α-1，2-甘露糖苷酶或其功能结构域的编码序列替换α-1，3-甘露糖基转移酶或α-1，6-甘露糖基转移酶基因的内部编码序列，构建同源重组突变基因序列；

b)将步骤a)获得的重组突变基因序列插入具有筛选标志序列的载体中，得到重组质粒；

c)将N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I和β-1，4-半乳糖基转移酶的编码序列分别与各自定位信号编码序列相连接，得到两种融合基因序列；

d)将步骤c)获得的两种融合基因序列插入具有筛选标志序列的载体中，得到重组质粒；

e)将α-2，6-唾液酸转移酶编码序列和唾液酸转运蛋白编码序列连接，得到融合基因序列

f)向载体中插入唾液酸合成酶编码序列使与载体内的筛选标志编码序列相连接，然后再向载体中插入步骤e)获得的融合基因序列，得到重组质粒；

g)将(i)步骤b)得到的重组质粒，(ii)步骤b)和步骤d)得到的重组质粒，或者(iii)步骤b)、d)和f)得到的重组质粒，导入工程菌株，借助筛选标志筛选发生表型改变的工程菌株；

h)在培养基中对所述工程菌株进行培养和诱导表达，收集上清中的糖蛋白并对其N-糖基化修饰糖链进行分析，确认工程菌株表达的糖蛋白N-糖基化修饰为预定糖链。

2.权利要求1所述的方法，其中所述的α-1，2-甘露糖苷酶编码序列为SEQ ID NO：1。

3.权利要求1所述的方法，其中所述的N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I及定位信号的编码序列为SEQ ID NO：2。

4.权利要求1所述的方法，其中所述的β-1，4-半乳糖基转移酶及定位信号的编码序列为SEQID NO：3。

5.权利要求1所述的方法，其中所述的α-2，6-唾液酸转移酶和唾液酸转运蛋白的编码序列为SEQ ID NO：4。

6.权利要求1所述的方法，其中所述的唾液酸合成酶的编码序列为SEQ ID NO：5。

7.权利要求1所述的方法，其中所述的α-1，2-甘露糖苷酶编码序列、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I及定位信号的编码序列、β-1，4-半乳糖基转移酶及定位信号的编码序列、α-2，6-唾液酸转移酶和唾液酸转运蛋白的编码序列以及唾液酸合成酶的编码序列从哺乳动物、植物、真菌和细菌中PCR扩增获得。

8.权利要求1所述的方法，其中所述的α-1，2-甘露糖苷酶编码序列、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I及定位信号的编码序列、β-1，4-半乳糖基转移酶及定位信号的编码序列、α-2，6-唾液酸转移酶和唾液酸转运蛋白的编码序列以及唾液酸合成酶的编码序列依据Genebank序列通过人工合成。

9.权利要求8所述的方法，其中所述的人工合成为根据酵母密码子偏嗜性人工合成。

10.权利要求1所述的方法，其中所述的预定糖链的末端糖基为选自甘露糖、葡萄糖、半乳糖和唾液酸中的一种或多种。

11.权利要求1或8所述的方法，其中所述的预定糖链的结构为选自下列其中的一种或多种：Man₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂和SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂。