[发明专利]构建表达预定糖链修饰糖蛋白工程菌株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质糖基化工程领域，本发明涉及借助基因工程手段构建表达预定糖链修饰的工程菌株的方法，本发明还涉及对糖蛋白N-糖基化修饰糖链的设计与改造，根据需要，所述糖蛋白可以含有结构为Man₅GlcNAc₂、GalGlcNAcMan₅GlcNAc₂和/或SAGalGlcNAcMan₅GlcNAc₂的修饰糖链。

背景技术

蛋白质药物一直是全球开发的热点。目前已有多种重组蛋白在临床治疗中发挥着重要的作用，如胰岛素、生长激素等。这类重组蛋白大多属于糖蛋白，即在多肽骨架的一个或多个位点上共价结合有寡糖的糖基化修饰蛋白。糖蛋白中糖链的主要功能有两大类：a)参与分子内作用，如蛋白质的正确折叠、细胞内定位、生物活性、溶解度、抗原性、生物半寿期、蛋白酶敏感性等；b)参与分子间作用，如趋靶于溶酶体、趋靶于组织、细胞-细胞黏附和结合病原体等。归根结底，糖链影响着蛋白质的整体构象，从而影响由构象决定的所有功能。

糖蛋白上的糖链从连接方式上可分为两类：一类是与天冬氨酰(Asn)残基连接，即N-连接糖蛋白，另一类与丝氨酸或苏氨酸连接，称为O-连接糖蛋白。

N-糖链通常都有一个五糖核心：[Manα1→6(Manα1→3)Manβ1→4GlcNAc β1→4GlcNAc]-((Man)₃(GlcNAc)₂)，根据它们的外层链结构的不同，可分为：高甘露糖型(High mannosetype)，杂合型(Hybrid type)与复合型(Complex type)。如图1所示，三者之间的区别在于：高甘露糖型只含有多个α连接的甘露糖残基，而复杂型具有岩藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)和唾液酸(SA)为组分的糖链天线，杂合型则兼具二者特点。许多研究表明：三种类型的糖链具有共同的生物合成起源，即高甘露糖聚合物前体。该前体并非直接在蛋白质上合成出来的，而是在脂质载体多萜醇(Dol)上合成寡糖链后转运到蛋白质受体上。

前体物(Glc)₃(Man)₉(GlcNAc)₂从脂供体在穿过内质网粗面(RER)膜时转到新生肽的Asn上，加工过程是以一个特异α1→2葡萄糖苷酶去除葡萄糖末端开始的。然后内部的两个葡萄糖残基被α1→3葡萄糖苷酶II切除，这些葡萄糖苷酶和α1，2-甘露糖苷酶都位于RER上。有人推测，葡萄糖修饰的目的是为了更有效地将蛋白从RER运到高尔基(Golgi)体。

糖蛋白到达Golgi体后，那些最终成为复合性结构的寡糖，通过N-己酰氨基葡萄糖转移酶I添加N-己酰葡萄糖胺残基，由Golgi体内的α-甘露糖酶II切除两个甘露糖残基，随后由GlcNAc转移酶加入天线上的GlcNAc残基。同时，Fuc转运酶可能转运一个Fuc到糖链的GlcNAc上。复合型寡糖的合成最后步骤发生在Golgi体的反面囊腔中。此时Gal或SA转移酶催化添加Gal和SA。最后新合成的糖蛋白离开Golgi体，运送到最终目的地。

最终的寡糖结构在很大程度上取决于糖蛋白在处理过程中与糖基化酶和糖基转移酶的作用顺序，以及它们特异性作用，许多不同的酶催化不同的反应，最后形成最终的寡糖结构。

酵母是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统之一((J.M.Cregg，2000 FEMS MicrobiologyReviews 24(1)45-66)。该系统兼有原核表达系统和真核表达系统的优点：易于操作培养、快速生长、表达量高，同时又能对外源真核基因进行正确翻译和翻译后加工与修饰，并能对许多蛋白质产物进行分泌表达，使产物易于提纯。已用该系统成功表达了数百种来自病毒、细菌、真菌、动植物和人的蛋白，如胰岛素、白介素、人血清白蛋白、肿瘤坏死因子、乙肝表面抗原、水蛭素等等。

虽然酵母和哺乳动物具有相同的糖基化起始步骤及内质网中的修饰过程，但由于酵母高尔基体中常产生高甘露糖型糖链并且缺少部分合成复杂型糖链的所需的系列酶，所以酵母工程菌株所表达糖蛋白的N-糖基化修饰主要为高甘露糖型。众所周知，高甘露糖型糖链糖蛋白具有很强的免疫原性，且在人体中半衰期短，易被清除。同时，不同类型的糖基化修饰对治疗性蛋白质的性质与疗效有很大影响。因此利用基因工程手段对酵母工程菌株进行遗传改造，使其产生具有不同类型糖基化修饰的糖蛋白，对于研究其性质、功能与疗效尤为有用。