[发明专利]凝血酶直接抑制剂多肽水合盐及合成方法

权利要求书

1.凝血酶直接抑制剂多肽水合盐的制备方法，所述凝血酶直接抑制 剂多肽水合盐为H-D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp- Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH的多肽水合盐，通式为 C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·mX·nH₂O，X为醋酸、盐酸或三氟醋酸，m的取值范围为1 ≤m≤4，n的取值范围为2≤n≤12，其特征在于，合成方法以单个氨基 酸的形式偶联，合成方法为下述步骤：

1)C端第1个氨基酸对-烷氧基苯甲醇(Fmoc-Leu-Wang)树脂的脱氨基 端Fmoc保护；

2)C端第2个氨基酸与Leu-Wang树脂的偶联；

3)将C端第3-20个Fmoc保护的氨基酸依次逐个进行偶联；

4)最终产物20肽氨基端Fmoc保护的脱除；

5)脱除肽的侧链保护及肽从树脂上的裂解；

6)粗品的纯化。

2.根据权利要求1所述的凝血酶直接抑制剂多肽水合盐的制备方 法，其特征在于，脱氨基端Fmoc保护的试剂为1-50％的哌啶/溶剂(体 积比)；溶剂为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)或N-甲基吡咯 烷酮(NMP)；最终产物从树脂上裂解的裂解剂为95％三氟醋酸(TFA)∶ 2.5％Y∶2.5％H₂O，所述Y为三异丙基硅烷(TIS)、苯甲醚(Anisol)或 苯甲硫醚。

3.根据权利要求1所述的凝血酶直接抑制剂多肽水合盐的制备方 法，其特征在于，合成方法为下述步骤：

1)C端第1个氨基酸对-烷氧基苯甲醇(Fmoc-Leu-Wang)树脂的脱氨基端 Fmoc保护

(a)称取Fmoc-Leu-Wang树脂置于硅烷化的玻璃反应器中，每10mg 树脂加DMF1-10ml，使树脂完全浸入其中，溶胀25-60min；

(b)抽滤掉DMF，在树脂中加入1-10ml浓度为1-50％哌啶/溶 剂，轻微震荡下反应3-10min，抽滤掉反应液后，再加1-10ml浓度 为1-50％哌啶/溶剂，轻微震荡下反应10-20min，抽去反应液；

(c)用DMF×2、MeOH×2、DMF×2洗涤树脂，取出0.1mg树脂放入 小玻璃试管中，加入茚三酮检测试剂各一滴，100-110℃下反应4- 6min，溶液和树脂呈深蓝色，说明脱除Fmoc完全；

2)C端第2个氨基酸与Leu-Wang树脂的偶联

称取原料：Fmoc-Tyr(But)-OH：是树脂负载量的2-5倍；

DIC：是树脂负载量的2-5倍；

HOBt：是树脂负载量的2-5倍；

(a)将称取的Fmoc-Tyr(But)-OH和HOBt溶于1-10ml DMF中，加入 到反应管中，然后加入DIC，室温下振荡反应30-60分钟；

(b)用DMF×2、MeOH×2、DMF×2洗涤树脂，取出0.1mg树脂放入 小玻璃试管中，加入茚三酮检测试剂各一滴，100-110℃下反应4- 6min，溶液和树脂均呈浅黄色，说明偶联反应完全；

3)将C端第3-20个Fmoc保护的氨基酸依次逐个进行偶联

将C端第3-20个Fmoc保护的氨基酸按照上述1)、2)所述脱氨基端 Fmoc保护及偶联的方法依次逐个进行偶联，完成了20个氨基酸的偶联 反应；

3-20个氨基酸的称取量均为树脂负载量的2-5倍；

4)最终产物20肽氨基端Fmoc保护的脱除

(a)将上述20肽产物用DMF×2、MeOH×2、DMF×2洗涤树脂，向反 应管中加入1-10ml浓度为1-50％哌啶/溶剂，室温下轻轻振荡反应3- 10min，抽去反应液，再加入1-10ml浓度为1-50％哌啶/溶剂，反应 10-20min；

(b)用DMF×2、MeOH×2、DMF×2洗涤树脂后，取0.1mg树脂进行 茚三酮检测，溶液和树脂呈深蓝色，说明脱除Fmoc完全；

5)脱除肽的侧链保护及肽从树脂上的裂解

(a)将上述产物用DMF×2、MeOH×2、DCM×4洗涤后，在真空下 抽空干燥30-60min；

(b)该产物中不含有Arg(Mt r)、Cys(Trt)、Met，故选择 95％TFA∶2.5％H₂O∶2.5％Anisol(v∶v∶v)作为裂解剂；

(c)取出5-50mg干燥好的树脂，配制5-50ml裂解液，加入到反 应管中，在室温下反应2-4个小时后，将反应液滤到10-100ml的离心 管中，分别用少量TFA洗涤两次树脂，与滤液合并；

(d)滴加5-50ml预先冰浴的乙醚，这时有白色沉淀物析出，充分 振荡，使裂解产生的副产物溶解在乙醚中，在冰浴中放置15-30min，然 后离心，倾掉上层乙醚，再加入5-50ml冰浴的乙醚，使沉淀物充分悬 浮，离心，反复5次；

(e)在室温下放置，挥发掉乙醚，得粗品；

(f)将粗品进行质谱分析，主峰的分子量与理论分子量一致，为 目的产物；配制5-50ml裂解液，加入到反应管中，室温下轻轻振荡反 应2个小时，重复上述(c)-(e)操作，得到最终粗品；

6)粗品的纯化

粗品的纯化是利用半制备的HPLC进行，制备柱选择C18填料，流动 相A：0.1％TFA/H₂O(w/v)，B：0.1％TFA/CH₃CN(w/v)，检测波长为210- 254nm，将粗品溶解后上柱，收集流份，将流份进行质谱和HPLC分析， 产物的分子量与理论值一致，其纯度达到98％以上，减压蒸馏除去大部 分乙腈，冷冻干燥后得到该多肽的水合三氟醋酸盐，最终产物的组成为 C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·mX·nH₂O。