[发明专利]一种热敏磷酸酶的过量表达、纯化和表征

权利要求书

1.用于过量表达热敏性南极磷酸酶(TAP)的方法，包括

(a)将与一段表达亲水性寡肽的序列相融合的截短的TAP基因有效连接到T7启动子上；

(b)转化到宿主细胞中；和

(c)过量表达TAP。

2.根据权利要求1的方法，其中所述的TAP基因编码具有N末端和C末端的TAP蛋白，其中所述的TAP蛋白在N末端被截短，被截去的序列对应于信号序列，所述N末端具有亲水寡肽与之相连。

3.根据权利要求2的方法，其中所述的亲水寡肽是带有正电荷的肽。

4.根据权利要求3的方法，其中所述的带有正电荷的肽是组氨酸标记。

5.用于获得纯化的热敏性南极磷酸酶(TAP)的方法，包括

(a)获得权利要求1所述的转化宿主细胞；

(b)破坏所述宿主细胞以获得可溶性组分；和

(c)从所述可溶性组分中纯化TAP。

6.根据权利要求5的方法，其中所述的纯化TAP的步骤进一步包括柱分离，其中TAP结合于柱子，并从柱子上洗脱下来，从而实现分离。

7.分析热敏性南极磷酸酶(TAP)活性的方法，包括：

(a)向含有底物的pH大约为5.5-7.0的缓冲液中加入TAP；和

(b)测定在限定的时间内和限定的温度下从所述底物上去除的磷酸基的量，以确定TAP活性。

8.根据权利要求7的方法，其中所述的缓冲液包括ZnCl₂和MgCl₂盐。

9.根据权利要求7的方法，其中所述的缓冲液是Bis-Tris丙烷。

10.根据权利要求7的方法，其中所述的底物是核酸。

11.根据权利要求10的方法，其中所述的底物是核酸上的末端核苷酸。

12.根据权利要求7的方法，其中所述的底物是磷酸化的糖。

13.根据权利要求7的方法，其中所述的底物是磷酸化的肽或蛋白。

14.截短的具有酶促活性的热敏性南极磷酸酶(TAP)，其中所述的截短对应于信号序列的去除，该磷酸酶具有C末端和N末端，其中所述N末端共价连接到亲水性前导序列上。

15.根据权利要求14的磷酸酶，其中所述的亲水性前导序列是寡肽。

16.根据权利要求15的磷酸酶，其中所述的寡肽是带有正电荷的寡肽。

17.根据权利要求16的磷酸酶，其中所述的带有正电荷的寡肽是组氨酸标记。

18.根据权利要求14的磷酸酶，其中所述的TAP在大约65摄氏度在不到30分钟的时间内充分地失活。

19.根据权利要求14的磷酸酶，其中所述的TAP活性在pH大于6的TRIS-HCL中充分稳定。

20.根据权利要求15的磷酸酶，其中所述的TAP活性在pH大约为7.4的TRIS-HCL缓冲液中充分稳定。

21.编码权利要求15所述的磷酸酶的DNA，其中编码组氨酸标记的序列融合到TAP的DNA序列的5’端。

22.包含权利要求21所述的DNA的载体。

23.转化了权利要求22所述的载体的宿主细胞。

24.TAP的充分稳定的制备物，其配方包括：TRIS-HCL缓冲液、MgCl₂、DTT和甘油。

25.根据权利要求19的TAP的充分稳定的制备物，其中pH为大约7.4。