[发明专利]一种热敏磷酸酶的过量表达、纯化和表征

说明书

本申请是分案申请，原申请的申请日为2004年2月20日、申请号为200480006407.X(PCT/US2004/004996)、发明名称为“一种热敏磷酸酶的过量表达、纯化和表征”。

背景技术

纯化的磷酸酶被分子生物学家们用于在体外条件下去除线性DNA、RNA、核苷酸和蛋白的磷酸基团。从线性DNA载体上去除两个5’端磷酸残基可阻止载体DNA在连接反应中重新环化，因为DNA连接酶只有在其中一个核苷酸含有5’端磷酸基而另一个核苷酸含有3’端羟基的情况下才催化临近的核苷酸之间磷酯键的形成。然而，带有5’端磷酸基的外源DNA片段可以有效地连接到去磷酸化的载体上，如此形成的含有两个缺口的开环分子可以很容易地转化到感受态细胞中。

已经有好几种不同的磷酸酶被开发出来以用于去除来自不同生物分子的磷酸基团，而且每种磷酸水解酶都具有它们自身的优点和缺点。第一个用于这种目的的磷酸酶是从大肠杆菌(E.coli)中纯化到的细菌碱性磷酸水解酶(BAP)。BAP的优点是对于所有类型的DNA末端都具有很好的活性。然而，这种磷酸水解酶由于对热和去污剂的异常稳定性导致其很难从反应中被去除(Sambrook，et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual Sections 1.53-1.72(1989))。据报道具有增加的热稳定性的一种突变BAP(美国专利号5,891,699，欧洲专利号0441252)已经被开发出来。牛肠碱性磷酸水解酶(CIP或者CIAP)是另外一种在分子生物学技术中广泛应用的磷酸酶(美国专利号5,773,226和5,707,853)。对于DNA的活性CIAP没有BAP高，但是却相对容易从反应中去除，这或者通过蛋白酶K处理之后用酚:氯仿抽提或者在存在EDTA的情况下热处理之后用酚:氯仿抽提来实现(Sambrook，et al.，supra(1989))。最近从北极甜虾(Pandalus borealis)中分离出的一种磷酸水解酶(SAP)(美国专利号6,387,634和6,379,940)被证明更加易于使用。它对于所有类型的DNA末端都具有和BAP类似的良好活性，而且据报道它还具有非常易于从反应中去除的优点，只要在65摄氏度处理15分钟就可以使之热失活(安玛西亚生物科学，皮斯卡特威，新泽西州)。

文献报道中出现的其它的热敏磷酸水解酶包括一种从南极嗜寒株系TAB5分离出来的被称为热敏南极磷酸酶(TAP)的酶(Rina，et al.，Eur.J.Biochem.267：1230-1238(2000))。TAP与其它的磷酸酶相比的优势包括热敏性和高的比活性。Rina等报道，这种磷酸酶对于底物对硝基苯磷酸(pNPP)具有1650单位/毫克蛋白的比活性，这一活性明显地高于其他任何已知的磷酸酶的活性。然而，这种由Rina等人报道的克隆得到的蛋白(supra(2000))在过量表达和纯化方面都有一些问题。比如，由Rina等人报道的纯化程序(supra(2000))需要多步超高速离心以便将TAP从与之联系的细胞膜上提取出来。这个程序不适合大规模工业生产(比如，涉及300克或者更多的细胞浆料的生产过程)。另外，采用Rina等人描述的程序过量表达TAP基因会导致该酶的产量非常低，这样对于大规模生产就不是非常节省费用。

发明概述

本发明的实施方案提供了在中性pH条件下具有更强的热敏性和增强的活性的碱性磷酸酶，以及在该蛋白的N末端的亲水前导序列(leader sequence)。该亲水前导序列可以是寡肽，比如带有净正电荷的寡肽例如His标记。这种磷酸酶的优势包括，通过升高温度至其它的反应物和产物不受影响的水平便能去除其活性。具有这些特性的磷酸酶的一个实例就是TAP，其在实施例中有详细描述。虽然这里描述的方法需要依赖一段亲水前导序列的存在，比如His标记，其融合到蛋白的N末端，但该蛋白优选不用镍柱来纯化，因为镍柱缓冲液对蛋白的活性具有负面影响。但是，亲水前导序列的存在令人吃惊地增加用其它柱组合物进行柱纯化时的产量。

在本发明的一个实施方案中，截短的但仍然具有酶活性的TAP被提供，其中所述的截短对应于一段信号序列的剔除，该磷酸酶具有一个C末端和一个N末端，其中所述N末端与一段亲水前导序列共价相连，该前导序列例如是带正电荷的寡肽，如His标记。这种截短的TAP可以在65摄氏度下15分钟之内基本失活。特别的是，这种截短的TAP在pH大于6或者更加特定地，在大约pH 7.4的Tris-HCl缓冲液中是基本稳定的。