[发明专利]一种拟丽突线虫的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物培养，具体为一种拟丽突线虫的培养方法。

背景技术

线虫是土壤中最为丰富的无脊椎动物，在土壤生态系统腐屑食物网中占有重要地位。线虫作为食物链中的重要成员广泛存在于土壤中，因其形态特殊性、食物专一性、分离鉴定相对简单，以及对环境的各种变化能做出较迅速的反应等特点，可将线虫作为土壤污染毒理效应研究的模式生物，为环境污染评价提供有价值的信息。

拟丽突线虫(Acrobeloides nanus)对土壤及水体中重金属污染具有很好的生物指示作用，采用室内培养该种线虫可用于污染环境的生物检测。拟丽突线虫是一种单性生殖的土壤居住的食细菌线虫(Laugsch，M.&Schierenberg，E.Differences in maternal supply and early development ofclosely related nematode species. International Journal of DevelopmentalBiology，2004，48：655-662)。拟丽突线虫成虫体长0.5mm左右。在世界不同地区的土壤中，拟丽突线虫是线虫群落的主要组成部分，它占据了大范围的土壤生活环境，占线虫群落的20％左右(De Goede，R.G.M.& Bongers，T.Nematode Communities of Northern Temperate Grassland Ecosystems.Focus，Giessen，Germany.1998)。拟丽突线虫以腐生和植物病原细菌为食，通过在土壤中传播细菌和病毒间接作用于有机质分解(Ikonen，E.K.Life historystudies of the hermaphrodite nematode Acrobeloides sp.with Pseudomonascepacia as a food source on agar.Nematology，2001，3：759-766)。拟丽突线虫的培养一般采用在培养基中加入Escherichia coli OP50品系细菌菌株，此菌株的培养采用的是LB培养基。但由于Escherichia coli OP50品系细菌菌株的继代培养和保存较难，而且易染杂菌，同时LB培养基较其他普通的营养基来说，成本较高。因此需要选择成本相对较低且易培养的菌株和培养基来培养拟丽突线虫。

发明内容

本发明的目的在于提供一种拟丽突线虫的培养方法；以大肠杆菌菌株为生长菌，接种培养得到细菌液，细菌液加入到线虫培养基，挑入拟丽突线虫，恒温培养得到纯种线虫。本发明操作简单，成本低廉，容易实施，解决环境污染的生物检测问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种拟丽突线虫的培养方法，将大肠杆菌E.coli菌株接入液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，在36.5～37.5℃下165～175次/分钟摇床振荡培养23～25小时得到细菌液；然后，将细菌液加入到线虫培养基，再挑入消过毒的无菌的拟丽突线虫，置于恒温恒湿培养箱，在湿度50～60％、温度20～30℃条件下培养5～11天，即可得到所培养的线虫。

所述大肠杆菌E.coli菌株为普通野生型大肠杆菌，菌株属于革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米，周身鞭毛，能运动，无芽孢。

所述的细菌液是将大肠杆菌菌株用接种环挑取，接入40～60mL液体的牛肉膏蛋白胨培养基上，每次接种大肠杆菌数量为1×10⁷～3×10⁷个，放进具有恒温功能的摇床，调节摇床温度36.5～37.5℃、摇动次数设置为165～175次/分钟，振荡培养23～25小时，得到细菌液。

所述的液体牛肉膏蛋白胨培养基按重量计为：牛肉膏5g、蛋白胨10.0g、NaCl 5g、蒸馏水1000mL，最后用2mol/LNaOH调节pH为6.5～7.5。

所述的线虫培养基按重量计为：3g NaCl、17g琼脂、2.5g蛋白胨，溶于975mL蒸馏水中，120～122℃灭菌，29.5～30.5分钟后分别加入5mg/mL胆固醇贮存液1mL、1mol/L CaCl₂ 1mL、1mol/L MgSO₄ 1mL、pH为5.9～6.1的1mol/L磷酸缓冲液25mL，摇动均匀，即得线虫培养基。