[发明专利]快速高通量筛选多环芳烃降解菌的改进固体双层平板法

权利要求书

1、一种快速高通量筛选多环芳烃降解菌的改进固体双层平板法，其特征在于，下层培养基采用普通无机盐琼脂培养基添加多种维生素和微量元素；上层培养基为以多环芳烃为唯一碳源的无机盐固体培养基，但选择低熔点琼脂糖代替普通琼脂；具体步骤如下：

1)土壤样品采集和处理：采集表层土壤样品，过1mm筛，4℃冰箱保存；

2)多环芳烃耐受菌群的富集培养：采用逐步提高底物浓度的方法对多环芳烃耐受菌群进行富集培养；

3)多环芳烃耐受菌群的分离：将2)中的富集培养液采用无菌生理盐水在无菌条件下进行10倍系列梯度稀释，取0.1ml、稀释度为10^-5～10^-7的富集培养液涂布LB固体培养基，置于30℃恒温培养箱中，培养48h；挑取具有不同菌落形态的单菌落各若干株，重新点种于LB固体培养基，并对菌落进行顺序编号，置于30℃恒温培养箱中，培养48h；

4)多环芳烃固体双层平板制备：在无菌的平皿中先倾入20ml下层培养基，既固体无机盐培养基添加0.1ml/L维生素母液；

待下层培养基凝固后，再加入10ml上层培养基，既以PAHs为唯一碳源的固体无机盐低熔点琼脂糖培养基；上层培养基配制方法：量取重量浓度1％PAHs无菌乙醇溶液100μl，加入10ml冷却至35℃的无机盐低熔点琼脂糖培养基中，使PAHs终浓度为100mgL^-1；

5)应用双层平板法高通量筛选多环芳烃降解菌：用灭菌牙签将3)中培养好的菌落点种于4)中制备的多环芳烃固体双层平板上，30℃恒温培养箱中，培养2～4周；

在紫外灯下观察，菌落周围出现降解暗圈则表明底物被降解，该菌株可确认为多环芳烃降解菌。

2、按照权利要求1所述的固体双层平板法，其特征在于，所述步骤1)中，表层土壤样品在距地面0-20cm处选取。

3、按照权利要求1所述的固体双层平板法，其特征在于，所述步骤2)中，逐步提高底物浓度的方法是：称取供试土壤样品5g，接入45ml以某PAHs组分为唯一碳源的液体无机盐培养基中，第一轮富集培养PAHs浓度为50mg L^-1，置于30℃恒温摇床上180rpm富集培养，富集培养时间根据不同PAHs组分而定，为7～10天，富集培养后，移取第一次富集培养液按10％的体积比例接入45ml以PAHs为唯一碳源的液体无机盐培养基中，进行第二次富集培养，共重复4次，每转接1次，PAHs的浓度提高50mg L^-1，即最后一次PAHs的浓度提高至200mgL^-1。

4、按照权利要求3所述的固体双层平板法，其特征在于，以PAHs为唯一碳源的液体无机盐培养基配制方法：取5g/L丙酮配制的PAHs母液，0.22μm滤膜除菌，量取50～200μl PAHs丙酮母液，加入已灭菌的250ml三角瓶中，待丙酮挥发完毕，加入50ml灭菌的液体无机盐培养基，使PAHs的终浓度为50～200mg L^-1。

5、按照权利要求1所述的固体双层平板法，其特征在于，所述步骤3)中，LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，NaCl 10g，琼脂粉20g，用蒸馏水定容至1000ml，pH 7.2～7.4。

6、按照权利要求1所述的固体双层平板法，其特征在于，所述步骤4)中，固体无机盐培养基配方为：液体无机盐培养基，加入2％重量的琼脂粉；维生素母液配方为：硫胺素10mg、核黄素5mg、维生素B65mg、泛酸钙20mg、对-氨基苯甲酸5mg、烟碱5mg、肌醇100mg，用无菌水定容至1000ml，用0.4μm滤膜过滤除菌。

7、按照权利要求1所述的固体双层平板法，其特征在于，所述步骤4)中，无机盐低熔点琼脂糖培养基配方：液体无机盐培养基，加入1％重量的低熔点琼脂糖。

8、按照权利要求4、6或7所述的固体双层平板法，其特征在于，液体无机盐培养基配方为：K₂HPO₄ 2g、KH₂PO₄ 0.5g、NaCl 0.5g、NH₄Cl 0.5g、MgSO₄0.2g、CaCl₂ 10mg、微量元素溶液1ml，用蒸馏水定容至1000ml；其中，微量元素溶液配方为：FeSO₂·7H₂O 2g、MnSO₄·H₂O 2g、Na₂MoSO₄·2H₂O 0.5g、H₃BO₄0.2g、CuSO₄·5H₂O 0.4g、ZnSO₄ 0.5g、NH₄VO₃ 0.2g、CoCl₂·6H₂O 0.5g、NiCl₂·6H₂O0.2g，用蒸馏水定容至1000ml。