[发明专利]快速高通量筛选多环芳烃降解菌的改进固体双层平板法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速高通量筛选多环芳烃降解菌的改进固体双层平板法，采用改进的固体双层平板法从土壤样品中快速、高通量筛选多环芳烃降解菌，属于污染土壤生物修复技术领域，适用于从环境样品中挖掘多环芳烃污染土壤生物修复微生物资源。

背景技术

多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbon，PAHs)是倍受关注的一大类环境污染物，分布十分广泛，在空气、土壤、地表水和地下水中均能检出PAHs组分。由于其生物可利用度差、半衰期较长，并且具有潜在的致畸、致癌和致突变效应，因此对人类健康产生了巨大威胁。菲、芘、荧蒽、苯并芘等16种多环芳烃化合物已被美国环保局(EPA)列入优先控制污染物黑名单。原油开采和冶炼过程中的工业污水排放和溢油泄漏事故是导致土壤PAHs污染的主要原因，我国石油工业发展迅速，但也随之带来严重的环境污染问题，有近千万亩的耕地受到不同程度的石油烃污染。因此，对PAHs污染土壤进行修复、恢复其生态功能以保障农产品安全是一项十分迫切的任务。

PAHs污染微生物降解技术是一种新型原位生物修复技术。它利用微生物种类繁多、代谢类型极为丰富等生物多样性原理与特点，通过从土著微生物群落中筛选高效PAHs降解菌株并回接原位污染土壤，达到清除土壤PAHs污染的目的。采用生物修复法降解PAHs污染物操作简单，可以克服物理、化学处理修复难度大、成本高，还会有二次污染的缺陷，应用前景广阔。其中，高效PAHs降解菌的筛选是进行有效生物修复的技术关键。

传统PAHs降解功能菌株的筛选一般采取“富集培养→随机挑取菌株→液体摇瓶验证降解率”的技术路线，这种方法往往带有一定的盲目性和随机性，工作量大、费时费力，且采用高效液相色谱(HPLC)测定成本较高。开发一种快速、便捷、高通量的筛选方法从环境样品中分离PAHs降解功能微生物资源对于环境微生物学者是一种迫切需求，类似的研究方法也能为其他功能微生物资源的开发提供借鉴。

此前，也有学者提出采用“单层平板法”初步筛选PAHs降解菌。“单层平板分离法”为在固体无机培养基上涂一层PAHs的丙酮或乙醇溶液，待有机溶剂充分挥发后，接种土壤样品悬液，使之均匀分布在PAHs表层；1-3星期后，在菌落的旁边可形成一个降解圈的则为PAHs降解菌。但在我们的实践操作中发现，采用涂布法制备以PAHs为唯一碳源单层固体平板不可行，因为有机溶剂挥发比较快，未等涂布均匀便析出PAHs晶体，因此不能制备均匀的PAHs固体平板；采用喷雾法制备单层固体平板较涂布法效果稍好，PAHs晶体分布比较均匀，但形成的降解圈边缘不整齐，不容易辨认，且喷雾过程需在通风橱中进行，很难控制无菌条件。

发明内容

本发明的目的是提供一种从土壤样品中快速高通量筛选多环芳烃高效降解菌的固体“双层平板分离法”。针对传统随机筛选方法的盲目性和费时费力的缺点，在单层平板法改进的基础上开发一种快速、便捷的筛选方法从环境样品中分离PAHs降解功能微生物。克服了单层平板法的许多不足，采用双层平板法能够使PAHs晶体均匀分布于上层培养基，形成的菌斑边缘清晰，易于辨认，且可在超净台中操作，容易控制无菌条件。从而，满足在实验室快速高通量初步筛选多环芳烃高效降解功能菌株的要求。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种快速高通量筛选多环芳烃降解菌的固体双层平板法，主要特征为：下层培养基为普通无机盐琼脂培养基添加多种维生素和微量元素，从而能够尽可能满足各种微生物的营养需求；上层培养基为以多环芳烃(PAHs)为唯一碳源的无机盐低熔点琼脂糖培养基，选择低熔点琼脂糖代替普通琼脂制作上层培养基，一方面可防止加入PAHs时由于高温导致的降解或者挥发；另一方面可使降解暗圈更清晰易辨。

使用上述“固体双层平板法”从土壤样品中快速高通量筛选PAHs高效降解菌的主要技术路线为：土壤样品采集→多环芳烃耐受菌群的富集培养和菌株分离→应用双层平板法初步筛选多环芳烃降解菌→HPLC法测定初筛菌株PAHs降解率复筛→确认高效菌株。详细实施步骤为：

1)土壤样品采集和处理：采集表层土壤样品(0-20cm)，过1mm筛，4℃冰箱保存；