[发明专利]一种新疆紫草细胞系和细胞培养生产新疆紫草紫草素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种新疆紫草细胞系，本发明还涉及该细胞系的制备方法及其培养物的生产方法。

背景技术

紫草为唇形目紫草科的一种以根入药的多年生草本药用植物。我国紫草资源大体可分为：新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst.)、硬紫草(Lithospermum erythrorhizonS.et Z.)、滇紫草(Onosma paniculata Bur.Et Fr.)、内蒙紫草(Arnebia guttata Bunge.)和西藏紫草(Onosma hookeri Clarke var.Longiflorum Duthie.)等类别。其中，新疆紫草因色素含量高和药理作用好而成为商品紫草的主要来源。

新疆紫草，习称软紫草，生长于海拔2500-4200米高的山野林丛中或向阳坡地，主要分布于新疆、西藏等地。株高15-35cm，外表紫红色，根粗壮。药用部分为其根部，药用成分为紫草素及其衍生物，主要包括：紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰阿卡宁、去氧紫草素、消旋乙酰阿卡宁、乙酰阿卡宁、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、消旋紫草素、β-羟基异戊酰阿卡宁、1-甲氧基乙酰紫草素、乙酰紫草素等，均属2，4-萘醌类有机化合物。

新疆紫草中所含的紫草素及其衍生物具有重要的药用价值。研究表明：紫草素及其衍生物具有抗肿瘤、抗艾滋病、抗病毒、抗菌、消炎以及促进循环系统循环的作用。外用可治疗皮肤癌、红斑狼疮、湿疹、带状泡疹和烧烫伤；内服可用于绒毛膜上皮癌、病毒性肝炎、肺癌及肝癌放化疗的辅助治疗。同时，紫草素及其衍生物因具有色价高、附着力强以及吸收紫外辐射功能强的优点，成为理想的天然红色素，国际上被誉为红色素之王。

虽然我国紫草资源较为丰富，但因人们过度采集，野生紫草资源已接近枯竭。但是在医药产业中对新疆紫草所含的紫草素及其衍生物的需求量又较大，因而出现了严重的供需矛盾。寻找到合适的新疆紫草的繁殖方法，快速生产紫草素及其衍生物以满足市场需求，具有重要意义。

目前，对新疆紫草组织培养方面的研究主要集中在两方面：一方面，从愈伤组织中筛选出优良细胞系，用以生产有用的次生代谢产物；另一方面，利用组织培养技术，诱导并筛选出优良品系，并进一步将其快速繁殖成完整植株。目前对于新疆紫草的研究主要集中在前者，但因其具有生产条件要求高，工艺复杂，流程长，生产成本高的缺点，因而该项技术的推广应用受到了极大地限制，有待于进一步研究。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种高产紫草素的新疆紫草细胞系。本发明以新疆紫草(其根、茎、叶，或者由种子萌发的无菌苗)作为外植体，诱导愈伤组织，通过反复继代培养，得到三种新疆紫草细胞系：白色系、黄色系、紫红色系；对3种细胞系分别进行继代培养，通过对其生长速度、紫草素化合物含量的检测，确定紫红色细胞系为长势较好，紫草素化合物含量最高的细胞系。从分离的细胞系中选择颜色鲜艳呈紫红色、结构致密、团块状的培养物，即为本发明细胞系。

本发明进一步对获得的紫红色细胞系进行继代培养和筛选，综合考察有效成分的含量以及生长特征，最终获得了可以无限传代培养的稳定高产新疆紫草细胞系。该细胞系具有以下特征：生长旺盛、颜色鲜艳、呈紫红色，结构致密、呈团块张，质地均匀、略偏硬，紫草素及其衍生物含量为培养物干重的6-8％，培养周期30-35天。具体地说，可通过如下方法制备得到上述细胞系：

1)新疆紫草无菌苗的培育

取天然新疆紫草的种子，已通过中国科学院研究所标本馆(国家植物标本馆)鉴定，先用75％酒精浸泡10-30s，然后用1％的氯化汞溶液消毒8-12min，再用无菌水反复冲洗4-5次，最后放在无菌滤纸上吸干种子表面水分，用无菌镊子接种在基本MS(配方建附表1)中添加10-30g/L蔗糖、0.6g/L琼脂的固体培养基，23-25℃，无光照培养，约10天种子即可萌发长出无菌苗。

2)愈伤组织的诱导和培养

取无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽做外植体，在无菌条件下，用无菌手术剪刀和无菌镊子将无菌苗根、茎、叶及子叶、胚芽切成2-5mm长的小段，接种在N6(配方见附表2)中添加0.2mg/L-0.5mg/L IAA、1mg/L-5mg/LKT、0.6g/L琼脂及30g/L蔗糖的固体培养基上，23-25℃暗培养，7-10天诱导出愈伤组织。

3)愈伤组织的继代筛选