[发明专利]具有雌激素活性的山茶黄酮苷A及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及对天然植物中具有药用活性的新成分的制备及应用。

背景技术

本发明人对山茶属植物的研究始于2002年，在与日本太田油脂株社和广西巴马万力山茶籽发展有限公司联合开发茶油的过程中，先后赴山茶属植物的主产区广西、云南、四川、湖南进行了资源调查。

山茶属(Camellia Linn.)植物属于山茶科，全世界有280种，主要分布于热带及亚热带。我国有250种以上，主产于西南至东南部。岭南地区分布最多，近百种。

药用收载的有茶的果实(茶子)、芽叶(茶叶)和根(茶树根)，油茶的种子(茶子心)、脂肪油(茶油)、油粕(茶麸)、花(茶子木花)和根皮(油茶根皮)，山茶的花及普洱茶叶。茶油亦为中华人民共和国药典收载。但对山茶属植物药用价值的现代研究甚少。

在资源调查的基础上，我们以资源丰富的山茶属植物为重点，分花、种子、果皮、茶麸和枝叶进行原料采集。继之，我们经历5年时间，对山茶属植物的药用价值进行了系统地研究，取得了突破性进展和多项创新性发现。特别是对其抗骨质疏松的研究。

本发明的发明人在研究过程中曾以维甲酸引发的大鼠骨质疏松模型为指标进行了活性筛选，发现南山茶(C.semiserrata Chi.)种子的乙醇提取物活性最强，明显高于阳性对照药。经定性、定量分析确认其有效部位为黄酮类成分，此项研究中标了国家自然科学基金项目《南山茶抗骨质疏松物质基础、作用机理及构效关系的研究》(批准号：30772714)。本发明的发明人认为有必要对此活性的进行分子基础的研究，以期获得具体的具有确定活性化合物。

发明内容

本发明的目的在于寻找该植物中具有药用活性的新的天然产物成分。

本发明所述的具有雌激素活性的山茶黄酮苷A具有如下结构式：

本发明的另一目的是提供该化合物的制备方法，该方法包括如下步骤：

①制备南山茶种子90～98％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物；

②以硅胶柱色谱分离上述乙酸乙酯萃取物，氯仿∶甲醇12～18∶1(体积)混合溶液等度洗脱，得混合物；

③继续以硅胶柱色谱分离上述混合物，氯仿∶甲醇18～22∶1(体积)混合溶液洗脱得山茶黄酮苷A。

上述山茶黄酮苷A的制备方法中，步骤②柱色谱洗脱液优选氯仿∶甲醇15∶1(体积)混合溶液。

步骤③中柱色谱洗脱液优选氯仿∶甲醇20∶1(体积)混合溶液。

本发明所述的上述山茶黄酮苷A的制备方法中，所述的步骤①的具体操作方法是：以90～98％工业乙醇加热回流提取，料液比1∶8～12(g∶ml)，温度90～100℃，提取3次，每次3小时；乙醇提取物浓缩成浸膏后以2～5倍蒸馏水混悬，并按照体积比依次用3倍石油醚和3倍乙酸乙酯各萃取3次，得乙酸乙酯萃取物。

其中，优选以95％工业乙醇加热回流提取，优选料液比1∶10(g∶ml)，优选温度95℃；混悬蒸馏水优选3倍体积。

具体来说，该山茶黄酮苷A的制备方法包括如下步骤：

①制备南山茶种子95％乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物：以95％工业乙醇加热回流提取，料液比1∶10(g∶ml)，温度95℃，提取3次，每次3小时；乙醇提取物浓缩成浸膏后以3倍蒸馏水混悬，并按照体积比依次用3倍石油醚和3倍乙酸乙酯各萃取3次，得乙酸乙酯萃取物；

②以硅胶柱色谱分离上述乙酸乙酯萃取物，氯仿∶甲醇15∶1(体积)混合溶液等度洗脱，得混合物；

③继续以硅胶柱色谱分离上述混合物，氯仿∶甲醇20∶1(体积)混合溶液洗脱得山茶黄酮苷A。

为了进一步纯化所得山茶黄酮苷A，还可以在最后加上用Sephadex LH20纯化的步骤，可得黄色粉末状产品。

通过结构式和系统命名在SciFinder Scholar数据库查询，证明所得的上述山茶黄酮苷A具有新颖的结构，是新化合物。

本发明继续对对上述山茶黄酮苷A的活性进行了检测：利用重组人雌激素受体基因酵母检测化合物的雌激素活性。重组人基因酵母法是使用比较广泛的一种体外检测方法，具有灵敏、快速、廉价等特点。它是将2个基因片段引入到酵母中，一个为人雌激素受体基因(hER)，另一个为与雌激素受体响应元件(ERE)相连的β-半乳糖苷酶(LacZ)报告基因。当类雌激素物质加入培养基中与ER结合，启动基因的转录，产生和分泌β-半乳糖苷酶。β-半乳糖苷酶能与其底物反应生成明黄色物质，通过测定A₄₂₀的吸光度可以测定β-半乳糖苷酶的活性，从而可以得出被测物质的雌激素活性。