[发明专利]一种直接产生妥布霉素的工程菌及其应用

权利要求书

1.一种直接产生妥布霉素的工程菌，其特征是:通过框架内删除失活的方法阻断黑暗链霉菌中tacA基因，主要包括以下步骤：

A、tacA基因阻断质粒的构建；

B、阻断质粒转化黑暗链霉菌；

C、转化子的筛选；

D、新组分妥布霉素的鉴定； 

所述的框架内删除失活的方法为：PCR分别获得tacA基因上下游分子量不低于500bp两个片段，分别在tacA基因上下游设计两对引物，以黑暗链霉菌总DNA为模板进行PCR扩增获得两个片段PCR1-2和PCR3-4，将两片段连接产物命名为△tacA，其删除了tacA基因内部260个碱基，将两者同时连接到pIJ2925中，再往片段的一端连入在黑暗链霉菌中能表达的红霉素抗性基因ermE，利用BglII酶切将三个基因片段连到穿梭载体pHZ132中；

所述的筛选为先筛选红霉素抗性菌株，无药传代后再从中筛选到红霉素敏感菌株，从中筛选到产新组分的转化子。

2.根据权利要求1所述的一种直接产生妥布霉素的工程菌，其特征是所述的转化是以E.coliET12567介导的结合转移方法。

3.根据权利要求1所述的一种直接产生妥布霉素的工程菌，其特征是所述的鉴定为发酵滤液采用薄层层析TLC、新组分采用HPLC-ELSD分析和MS分析。

4.权利要求1所述的工程菌在直接发酵产生妥布霉素中的应用。