[发明专利]一种直接产生妥布霉素的工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种直接产生妥布霉素的工程菌及其应用，具体地说，本发明是利用分子生物学操作技术，阻断黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)生物合成基因tacA，获得直接产生妥布霉素的基因工程菌株，可以在抗生素制药中应用。 

背景技术

黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)是1967年美国礼莱公司的研究人员从土壤中分离得到的，该菌株能产生一组抗生素，其中2、4、5’为主组分。组分2为安普霉素(Apramycin，Am)，组分4为6”-O-氨甲酰卡那霉素B(6”-O-Carbamoylkanamycin B，CKB)，组分5’为6”-O-氨甲酰妥布霉素(6”-O-Carbamoyl tobramycin，CTB)。组分4、5’经高温水解后分别形成卡那霉素B和妥布霉素。 

妥布霉素是一种广谱高效的抗生素，在体外对多种细菌有抗菌活性，特别是某些对庆大霉素耐药的铜绿假单孢菌有效，而且妥布霉素的耳、肾毒性相对较低，是临床上广泛应用的抗菌药。 

多年来科研工作人员对黑暗链霉菌的研究主要集中于常规诱变育种和优化生产工艺等方面取得一些进展。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程研究，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素生产等方面取得长足的进步。在分子水平，李天伯等克隆到一段50Kb区域，证明其中含有参与妥布霉素合成的dTDP-葡萄糖-4，6-脱水酶。Madan Kumar Kharel等利用同源杂交的方法克隆到一段13.8Kb氨甲酰妥布霉素生物合成基因簇，证明了其中tbmA、tbmB的基因功能，推断出氨甲酰妥布霉素的生物合成途径。 

目前，妥布霉素的生产方法是从黑暗链霉菌发酵液中分离得到氨甲酰妥布霉素，再经碱性条件下高温水解获取妥布霉素。该方法的缺点是杂质多，产品收率低，生产成本高。 

随着分子生物学技术的发展，使得利用基因工程的方法改造抗生素组分成为可能。Madan Kumar Kharel等克隆到黑暗链霉菌中妥布霉素部分合成基因簇，Blastn发现其中基因TacA为氨甲酰基转移酶，可能与6”位氨甲酰基合成有关。 

发明内容

本发明的目的是通过对tacA失活的方法，获得能直接产生妥布霉素的工程菌，该菌株已于2008年3月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.2409。 

本发明通过框架内删除失活的方法阻断黑暗链霉菌中tacA基因，主要包括以下几个步骤： 

A、tacA基因阻断质粒的构建； 

B、阻断质粒转化黑暗链霉菌； 

C、转化子的筛选； 

D、新组分妥布霉素的鉴定。 

框架内删除失活的方法为PCR分别获得tacA基因上下游分子量不低于500bp两个片段，将两者同时连接到pIJ2925中，再往片段的一端连入在黑暗链霉菌中能表达的抗生素抗性基因如红霉素抗性基因ermE，利用BglII酶切将三个基因片段连到穿梭载体pHZ132中。 

其中转化是以E.coliET12657(pUZ8002)介导的结合转移方法。筛选为先筛选红霉素抗性(erm^R)菌株，无药传代后再从中筛选到红霉素敏感(erm^S)菌株，从中筛选到产新组分的转化子。鉴定为发酵滤液采用薄层层析TLC、新组分采用MS分析和HPLC-ELSD。 

本发明既简化了生产工艺、又降低了生产成本，同时也更便于进行产品的质量控制。 

本发明所述菌株已于2008年3月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所)登记保藏，其分类命名为黑暗链霉菌(Streptomyces tenebrarius)，保藏编号为CGMCC No.2409。 

附图说明

图1是tacA基因双交换原理及酶切位点示意图 

图2是基因工程菌发酵产物组分TLC分析 

1为妥布霉素标准品，2为黑暗链霉菌H6(pSPU303-3)，3为野生型菌株黑暗链霉菌H6。A为氨甲酰妥布霉素，B为妥布霉素，C为安普霉素。 

图3是妥布霉素标准品和新组分的HPLC-ELSD图谱 

A为妥布霉素标准品，B为新组分 

图4是新组分的质谱分析图谱