[发明专利]一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法；更具体地说，涉及一种由猿猴病毒40大T抗原(SV40T)基因和泛嗜性逆转录病毒载体构成的重组病毒的制备方法。

背景技术

在生命科学和生物技术领域中，对细胞系存在着广泛的需求。动物细胞的短期培养比较容易，但要建立永生细胞系则有相当的难度。将永生化基因导入体外培养的细胞中表达而诱导其获得无限增殖的能力，是当前普遍采用的一种建系手段。在此过程中，携带并表达永生化基因的载体称为细胞永生化载体。猿猴病毒40大T抗原(SV40T)基因能诱导众多类型细胞发生转化，是目前最为常用和有效的永生化基因之一，已广泛用于人类(杨梅英、叶常青、刘雷华，SV40T介导的人胎儿永生化气管成纤维细胞系的建立，癌变·畸变·突变，1999，11：22-24)、哺乳动物(高峰、田玉科、杨辉等，猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠神经前体细胞株的构建，中华麻醉学杂志，2005，25：597-600)、昆虫(Tian Jian-xiao，Li Chang-you，Zheng Gui-ling，etal.A new cell clone derived from Trichopusia ni Tn5Bl-4 cells.Entomologia Sinica，2004，11：165-171)和甲壳动物(Tapay，L M，Lu，Y，Brock，J A，et al.Transformation of primary cultures of shrimp(Penaeus stylirostris)lymphoid(oak)organ with Simian virus-40(T)antigen.Proc Exp Biol Med，1995，209：73-78)等细胞的永生化研究中。SV40大T抗原的持续表达对成功诱导靶细胞的永生化表型至关重要。

迄今所使用的永生化载体有两种类型：I类是非整合型载体，II类是逆转录病毒载体；前者通过脂质体转染可进入任何类型的动物细胞，但是所携带的永生化基因只能核外暂时表达而导致永生化效率低下；后者则通过转导作用进入靶细胞，并与细胞基因组整合，从而保证了永生化基因在靶细胞内稳定表达，所以具有较高的永生化效率。然而，病毒侵入靶细胞需由特定的细胞表面受体介导，因此导致II类永生化载体对靶细胞具有选择性，从而限制了它的应用范围。

泛嗜性逆转录病毒载体(Pantropic retroviral vectors)是一类病毒外壳由粘性肺炎病毒外壳糖蛋白(VSV-G)组成的逆转录病毒载体。VSV-G通过与靶细胞的膜脂偶联以及膜融合介导病毒的侵入而无需通过细胞表面的特异蛋白受体介导。因此，泛嗜性逆转录病毒具有极其广泛的寄主范围(Burns，J C，Friedmann，T，Driever，W，et al.Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors：concentration to very high titer and efficient gene transfer intomammalian and nonmammalian cells.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90：8033-8037)，已成为基因转移系统的上佳选择。然而，迄今泛嗜性逆转录病毒载体尚未在细胞转基因永生化研究中得到应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，以克服现有永生化载体的上述缺陷，能较好地解决I类永生化载体的永生化效率低下和II类永生化载体的寄主范围狭窄的问题。

一种通用的整合型细胞永生化载体的制备方法，其步骤包括：(1)以猿猴病毒40基因组或携带有SV40大T抗原基因的质粒为模板，PCR扩增SV40T基因，SV40T基因序列如序列表中SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示；(2)通过DNA重组技术将SV40T基因定向插入逆转录病毒载体的多克隆位点，构建携带SV40T基因的重组逆转录病毒载体；(3)将步骤(2)得到的重组载体与包装质粒pVSV-G共转染GP-293细胞进行重组泛嗜性逆转录病毒包装，培养48-72小时后收获含有重组病毒颗粒的细胞上清液。