[发明专利]外源内共生菌向烟粉虱水平转染的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及外源内共生菌向烟粉虱水平转染的方法，属于农业生物技术领域。

(二)背景技术

生物入侵往往会对一个国家或地区的经济安全、生态安全、社会安全构成威胁。我国每年因生物入侵造成的直接经济损失达数千亿元，其中紫茎泽兰、松材线虫等13种外来物种，每年给农、林、牧、渔业生产造成的经济损失就达574亿元。当前，外来入侵我国的烟粉虱(B型)在广大地区暴发成灾，它是国际科技界有史以来唯一冠以“超级害虫”称谓的世界性入侵昆虫，它不仅直接吸取植物汁液、分泌蜜露影响植物光合作用，而且可传播110多种病毒病，每年给被入侵地区的农业生产造成巨大的经济损失；此外，它还能竞争取代土著烟粉虱或其他土著昆虫，影响生态系统。深入研究外来入侵物种的灾变机制及其防控技术是科学应对生物入侵这一世界性难题的基础与关键。目前，针对一种农业害虫而召开的国际会议并不多，而国际烟粉虱大会迄今为止已召开了4次。近年来，内共生菌对B型烟粉虱的影响及其机制成为了国内外烟粉虱灾变机制研究的热点问题之一，这对于利用内共生菌控制烟粉虱(B型)种群具有重要的潜在价值。

由于内共生菌不能体外大量培养，同时烟粉虱成虫与伪蛹个体较小(＜1mm)，这成为内共生菌与烟粉虱互作研究及其利用技术的瓶颈。正是由于上述技术瓶颈的存在，长期以来，国内外对烟粉虱内共生菌的研究均采用抗生素处理的方法证实内共生菌对宿主烟粉虱的适合度影响。这种方法存在多种缺点，例如：1)抗生素抑制而不能根除目的内共生菌，而且是抑制所有的内共生菌，从而不能确定具体某个内共生菌的生物学功能；2)不能将目的内共生菌转入烟粉虱种群，因而阻碍了对内共生菌潜在利用价值的研究。实验过程中，使用固定棒固定其他昆虫的方法对于微型昆虫不合适，因为微型昆虫个体容易滑动；双面胶固定其他昆虫的方法对于微型昆虫不合适，因为双面胶容易粘住这些昆虫导致其死亡。因此，如何将外源内共生菌及时有效的转染到烟粉虱体内，是当前内共生菌与烟粉虱互作及其利用研究中迫切需要解决的问题。此外，目前国内外进行烟粉虱其他试验如RNAi注射试验时，采用麻痹后的烟粉虱成虫，而烟粉虱成虫苏醒快，不好固定，且固定后的烟粉虱成虫容易死亡，这也是影响对烟粉虱进行实验过程中需要解决的问题。

(三)发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种将外源内共生菌向烟粉虱水平转染的方法。

本发明中外源内共生菌向烟粉虱水平转染的技术体系是将米蛾(Corcyra cephalonica)内共生菌沃尔巴氏体(Wolbachia)离体纯化后，利用显微注射技术转染到烟粉虱体内，生物学研究表明该内共生菌能够垂直传播。

名词注释：

SPG缓冲液：为218mM蔗糖，3.8mM KH₂PO₄，7.2mM K₂HPO₄，4.9mM L-谷氨基酸，混合配置的缓冲液，pH＝7.2。

一种将外源内共生菌向烟粉虱水平转染的方法，包括外源内共生菌沃尔巴氏体(Wolbachia)的制备、烟粉虱伪蛹受体的制备、注射、注射后烟粉虱伪蛹受体的培养，其特征在于，烟粉虱伪蛹受体的制备具体步骤如下：

将双面胶一面贴在洁净的载玻片上，在双面胶的边缘切除约1mm的胶纸，露出1mm的胶面；采集烟粉虱伪蛹并背部向上固定在该胶面上，即得烟粉虱伪蛹受体。

优选的，所述外源内共生菌沃尔巴氏体(Wolbachia)的制备具体步骤如下：

将米蛾的卵利用SPG缓冲液漂洗4-8次；在灭菌管中，使用SPG缓冲液将米蛾的卵进行匀浆，300g离心5-10min，将上清液转移到干净的0.2mL灭菌管中，12000g离心10-20min，除去上清液，用SPG缓冲液将沉淀悬浮并在300g离心5min，取上清夜，即为纯化的内共生菌，将纯化的内共生菌在室温下保存备用。

优选的，所述的注射步骤具体如下：

取直径小于20μm的针头；在IM 300注射仪上将制得的外源内共生菌沃尔巴氏体分别注射入制得的烟粉虱伪蛹受体内，得水平转染后的烟粉虱伪蛹。

优选的，所述注射后烟粉虱伪蛹受体的培养的具体步骤如下：

将水平转染后的烟粉虱伪蛹放于恒温27℃、湿度(RH)60％-80％的气候培养箱中；培养24小时，然后采集羽化成虫；

更优选的，外源内共生菌沃尔巴氏体(Wolbachia)的制备步骤中，所述的室温保存时间为0-5小时。

一种内共生菌沃尔巴氏体(Wolbachia)在防治烟粉虱中的应用。