[发明专利]一种含有CpG序列的PRRSV ORF5基因核酸疫苗的制备方法

权利要求书

1、一种含有CpG序列的PRRSV ORF5基因核酸疫苗的制备方法，其特征在 于制备步骤如下：

1)选用CpG-ODN序列引物

A：5’-CTCATCGATCCTATCGATCCATCGATCCTATCGATCCTATCGATCCTATCGATGGGCC-3’

B：5’-CATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATAGGATCGATGAGGGCC-3’

2)PCR扩增ORF5基因

设计扩增ORF5基因的引物为：

P5s：5’-AATCTAGCTAGCCGCCACCATGTTGGA-3’，

P5r：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’；

为便于克隆，在上游引物和下游引物中分别添加了NheI酶切位点和NotI 酶切位点；

以质粒pIRES—ORF5ORF6为扩增模板，扩增ORF5基因，反应体系如下： 10×PCR buffer 5μl；dNTP Mixture4μl；P5s 2μl；P5r 2μl；模板2μl； Ex Taq E 0.5μl；用ddH₂O补至50μl；扩增条件：预变性：95℃ 5min；变性： 94℃ 1min退火：50℃ 1min延伸：72℃ 1min共30 Cycles最终延伸72℃ 10min；

3)pVAX1—ORF5载体的构建

用限制性内切酶NotI/Nhe I消化PCR纯化产物和pVAX1，分别获得ORF5基 因片段和线性载体pVAX1，将产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳，按照上海生工胶 回收试剂盒说明书进行；连接、转化、挑菌、提质粒、用限制性内切酶NotI/Nhe I鉴定；

4)CpG-pVAX1-ORF5重组质粒的构建

将合成的两条CpG序列引物A、B按1:1比例混合于95℃加热5min，后置于室 温冷却，退火2h，获得CpG-ODN短序列；用限制性内切酶ApaI消化质粒pVAX1- ORF5，将pVAX1-ORF5和CpG-ODN按1∶3比例进行连接、转化、挑菌、质粒小提、 用限制性内切酶NotI/Nhe I鉴定；将含有CpG-pVAX1-ORF5重组质粒的菌样送往 联合基因有限公司生物公司，用Thermol Cyling全自动测序仪进行序列测定；

5)重组质粒的纯化和转染细胞

质粒的大量制备及纯化，按常规方法进行，溶于TE(pH8.0)中，测定质 粒DNA纯度，贮存于-20℃；质粒DNA的定量：以TE(pH8.0)为空白对照，用TZK-800Z 紫外分光光度计测定波长260nm和280nm的核酸溶液光密度(OD)值，用含10％小 牛血清的MEM培养基，在37℃，5％CO2的条件下培养COS-7细胞，待细胞长至对 数生长期质粒转染细胞；采用脂质体法：按说明书进行，设立空载体对照组；

6)RT-PCR检测ORF5基因的转录情况：收集筛选后稳定表达的细胞，按常规 方法提取细胞总RNA，经反转录后用引物P5s和P5r扩增；

7)间接免疫荧光实验(IFA)

将质粒转染到长有70％COS-7细胞单层的玻片上，5％CO₂、37℃培养三天后， 取出玻片，用PBS液冲洗三次，100％冷丙酮固定15～30min，再用PBS液洗涤三 次；用含有5％BSA封闭2h，冲洗三次，每次5min；加入一抗(猪抗PRRSV血清)， 37℃作用2h后，冲洗3次；加入二抗(异硫氰荧光素标记的山羊抗猪IgG)， 室温避光作用1h，冲洗3次；吸干，滴加50％甘油水溶液，倒置于载玻片上， 荧光显微镜下观察；

8)动物免疫

6周龄雌性SPF昆明小鼠，体重18～26g，购于青岛药检所实验动物中心； 免疫6周龄雌性SPF昆明小鼠，取脾淋巴细胞检测T淋巴细胞亚群的数量和淋巴细 胞转化实验；采用间接ELISA方法分别测定小鼠血清中抗PRRSV抗体水平的变化； 将全部血清均做1∶40倍稀释，最后测OD值；

4周龄长白仔猪，经ELISA检测其PRRS抗体阴性；随机分为5组，每组5 只，按如下五组免疫：(A)正常对照组(注射生理盐水)；(B)空载体PVAX1 组；(C)PVAX1-E组；(D)CpG-pVAX1-E组；(E)灭活疫苗组；B、C、D实 验组剂量均为800ug/只，用前混合均匀，肌肉注射，免疫三次，间隔21天；正 常对照组注射1ml生理盐水，灭活疫苗组(E组)按说明书接种；于每次免疫后 10天和攻毒后四周采血，分离血清，-20℃保存备用；

9)动物试验：

分别进行淋巴细胞转化试验(MTT法)，用IDEXX试剂盒检测猪外周血抗体 水平，用IL-2的定量检测试剂盒检测IL-2的含量，猪体内PRRSV的RT-PCR检 测，攻毒后4周将猪宰杀，取肺脏、肝脏、脾脏、扁桃体、腹股沟淋巴结、肠 系膜淋巴结、肩前淋巴结、心脏、肾脏、脑组织、十二指肠等组织器官观察病 理变化。