[发明专利]一种含有CpG序列的PRRSV ORF5基因核酸疫苗的制备方法

说明书

1、技术领域

本发明涉及基因疫苗使用的佐剂和其制备方法，具体是一种含有CpG序列的 PRRSV ORF5基因核酸疫苗。

2、背景技术

自从上世纪20年代以来，许多物质被尝试作为免疫佐剂，但只有铝胶佐剂 获得人类疫苗的许可，并大量用于猪疫苗。它作为抗原的储存库和载体，缓慢 释放抗原从而延长诱导机体的体液免疫反应，但缺点是仅诱导Th2体液免疫反 应，抗体以IgG1型为主，无TCL反应。油佐剂和弗氏完全佐剂虽能明显提高免 疫应答能力，但在实际应用中常出现不良反应，如注射部位肿胀、疼痛、发烧， 或发生过敏等，仅限用于实验室动物试验。206佐剂是目前商品化的高效动物疫 苗油佐剂，已广泛使用于动物疫苗中，实践证实是可靠的、有效的和安全的， 但需要进口，价格较高。

基因疫苗(gene vaccine)是近年来随着基因治疗而发展起来的第三代疫 苗。它是将编码某一特定保护性抗原蛋白的外源基因与真核表达载体进行重组 后，直接导入动物体内，利用免疫原基因在宿主体内表达出抗原蛋白质引起机 体的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。与常规疫苗相比，基因疫苗具 有如下优点：免疫效果好；不散毒，无污染；保护性免疫持续时间长；方法简 便、价格低廉；核酸疫苗具有相同的理化性质，为联合免疫提供了可能；便于 贮藏和运输；不受个体已有的免疫反应(如母源抗体)的影响。

PRRSV基因组中ORF2～7编码病毒的结构蛋白，其中用于基因免疫方面研究 较多的是ORF5、ORF3以及ORF4。据报道，ORF5有6个抗原决定簇，其中一个 是血清型特异性线性中和决定簇，能在体外中和病毒的感染性，这说明ORF5可 以诱导产生中和抗体。最近，Patrick等^[20]又证明病毒的中和作用与抗GP5滴度 呈显著相关性，另外，Pirzadeh等报道说，用含编码ORF5的质粒进行DNA免 疫，可使接种猪产生抗ORF5的特异性中和抗体，接种猪免于强毒攻击造成的全 身性病毒血症和肺部病变，并使间质性肺炎和支气、管肺泡炎明显减轻。 Meulenberg等在LV株ORF4编码的蛋白GP4中鉴定了一个中和区，表明该蛋白 诱导的抗体具有中和作用。美国学者Molitor等又通过实验证明可以用含ORF5、 ORF3的基因构建基因免疫质粒，进行基因免疫。由于目前用来防制PRRS的灭活 疫苗和弱毒疫苗均存在着不同程度的缺陷，因此利用生物技术手段开发新型疫 苗以取代现用的常规疫苗已经是势在必行。新型疫苗是以基因工程疫苗为核心， 主要包括核酸疫苗、亚单位疫苗、基因缺失疫苗、活载体疫苗、合成肽疫苗以 及抗独特型抗体疫苗等。虽然PRRS病毒的基因序列已经全部测定，但其致病机 理以及病毒结构蛋白的功能仍不十分清楚，所以这无疑为本病新型疫苗的研制 带来了重重困难，尽管如此，现在国外已有许多学者致力于这方面的研究，与 此同时，国内学者也正对其处于积极探索之中。如何进一步提高传统疫苗的免 疫效果是今后努力的方向。高效免疫增强剂的应用，能全面提高机体的整体免疫 水平，增强抗病防御和免疫应答能力，提高疫苗保护率。其中，CpG-ODN(CpG寡聚 脱氧核苷酸)的研究是其中的焦点。CpG序列已被证实能作为疫苗的高效免疫增 强剂，使用得当能够大幅度提高疫苗的免疫保护率和机体的免疫水平。近来大量 免疫学研究证实：含CpG序列的DNA分子具有以下免疫效果：(1)诱导B细胞增 殖、分化、成熟和分泌免疫球蛋白；(2)抗诱生的细胞凋亡；(3)诱导单核细胞 分泌IL-12及其他细胞因子；(4)活化自然杀伤(NK)细胞的裂解活性和干扰素 (IFN-γ)分泌。

当前养猪业重大疫病发生和流行愈加复杂的形势——旧病未除，新病又起， 疫情不断，这就要求我们必须运用新的科学理论和生产技术来发展猪用安全、 高效疫苗预防和控制各种疫病的发生和流行，而佐剂研制是疫苗研究的主要组 成部分。

3、发明内容

本发明的目的是提供一种新的供猪免疫疫苗使用的基因佐剂的制备方法，即一 种含有CpG序列的PRRSV ORF5基因核酸疫苗的制备方法。