[发明专利]一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法

权利要求书

1.一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，步骤如下：

(1)异藻蓝蛋白的提取

将蓝藻用冻溶和低离子强度溶涨的方法解体溶解，离心分离，取上清液，即得异藻蓝蛋白浆液；

(2)异藻蓝蛋白的初步纯化

用硫酸铵沉淀法，将异藻蓝蛋白从异藻蓝蛋白浆液中沉淀出来，离心收集沉淀，再用pH6.8～7.0的20mM磷酸缓冲液，溶解并透析，除去硫酸铵，得异藻蓝蛋白粗提液；

(3)羟基磷灰石层析提取异藻蓝蛋白

使用羟基磷灰石在异藻蓝蛋白粗提液中吸附富集异藻蓝蛋白，然后用磷酸缓冲液进行洗脱，得异藻蓝蛋白溶液；

(4)离子交换制备高纯度异藻蓝蛋白。

2.如权利要求1所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的蓝藻为螺旋藻。

3.如权利要求1所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(1)异藻蓝蛋白的提取的具体操作步骤为：将蓝藻藻体加入pH6.8～7.0的0.02mol/L磷酸缓冲液，在-20℃下冷冻，然后在20～25℃下，融化2～3h；反复冻融2-4次后，蓝藻悬液在4℃下，8000rpm～10000rpm离心10min～15min，上清液即为异藻蓝蛋白浆液。

4.如权利要求1所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(2)异藻蓝蛋白的初步纯化的具体操作步骤为：向异藻蓝蛋白浆液中加入固体硫酸铵，至浓度为30％，为重量体积比，放置4～5h，然后在4℃下，10000rpm～11000rpm离心10min～15min，取上清液，向上清液中加入固体硫酸铵，至最终浓度为60％，为重量体积比，放置4h以上，然后在4℃下，10000rpm～11000rpm离心10min～15min，弃上清，取沉淀；将沉淀溶于pH6.8～7.0的20mM的磷酸缓冲液中，然后用pH6.8～7.0的20mM的磷酸缓冲液进行透析，收集透析液，即得异藻蓝蛋白粗提液。

5、如权利要求1所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(3)羟基磷灰石层析提取异藻蓝蛋白的具体操作如下：将预先用pH6.8～7.0的20mM磷酸缓冲液平衡过的羟基磷灰石，加入异藻蓝蛋白粗提液中，将吸附满异藻蓝蛋白的羟基磷灰石从溶液中取出，使用pH6.8～7.0的20mM磷酸缓冲液冲洗羟基磷灰石，将羟基磷灰石上残余的C-藻蓝蛋白冲洗掉，再用恒定离子强度的缓冲液进行洗脱，将异藻蓝蛋白洗脱下来，即得异藻蓝蛋白溶液。

6、如权利要求5所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述恒定离子强度的缓冲液为pH6.8～7.0的100mM磷酸缓冲液。

7、如权利要求1所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述步骤(4)离子交换制备高纯度异藻蓝蛋白的具体操作如下：取步骤(3)制得的异藻蓝蛋白溶液，在pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液中透析，然后取透析后的溶液，在DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱上，用pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液洗脱，再用pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液和pH3.6、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液各100mL进行梯度洗脱，洗脱速度为60～70mL/h，检测波长280nm，收集洗脱的蓝液体，得到纯化的异藻蓝蛋白。

8、如权利要求7所述的快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，其特征在于，所述的DEAE Sepharose Fast Flow离子交换色谱柱是经pH5.0、含0.05mol/L NaCl的20mmol/L醋酸缓冲液预先平衡的，规格为0.6×10cm。