[发明专利]一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，属于蛋白质分离纯化技术领域。

背景技术

为了研究蛋白质等生物大分子的细胞定位、相互作用及其动态变化，研究人员急需新技术和新材料来实现对蛋白质等生物大分子的“标识”、“阅读”和“查询”。现在常用的荧光标记，由于荧光染料分子荧光特性的限制(荧光光谱较宽、量子产率低)，远远不能适用于高通量的生物大分子专一标识。

藻胆蛋白是一类光合作用捕光色素-蛋白质复合物，主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数甲藻中。在光合作用中起捕获和传递光能的作用，具有强烈的荧光。在蓝藻和红藻中，藻胆蛋白和少量无色连接蛋白组成超分子复合体——藻胆体，高效的吸收和传递光能。在80年代中期，美国研究藻类光合作用的学者提出将藻胆蛋白作为荧光标记物，用于诊断试剂。由于其独特的优点，藻胆蛋白和藻胆蛋白标记的诊断试剂在90年代初进入国际市场。

同常用的荧光标记物相比，藻胆蛋白具有下列优点：生产过程安全、无毒，光能吸收强，荧光产率高，超过90％，背景光干扰和假阳性率低，在pH4-11的范围内稳定，可以作双色、三色和四色标记。所以，这类试剂的应用范围不断扩大。但是，由于价格昂贵，尚未应用到普及型的临床诊断试剂。我国全部进口，也仅限于用细胞流式仪进行的诊断。

藻胆蛋白及其诊断试剂主要由美国生产，德国也有产品向我国推销，英国和我国台湾正在研制。最早研制产品的是美国分子探针公司(Molecular Probes，Inc.)，现在Sigma公司共有6种藻胆蛋白产品，藻胆蛋白-Biotin/Avidin标记物12种，RPE-IgG或RPE-IgM12种，RPE单抗标记物3种。藻胆蛋白生产沿用已公开的实验室方法。藻胆蛋白的种类包括异藻蓝蛋白(APC)、藻蓝蛋白(PC)、藻红蓝蛋白(PEC)和藻红蛋白(PE)四大类。其中存在于蓝藻中的APC是目前常用的藻胆蛋白荧光探针之一，因为，APC亮度大，斯托克位移大。我国螺旋藻等蓝藻已经开始了工业化培养，资源非常丰富，是分离纯化APC的很好的材料。国际市场上决定购、销关系的主要是价格因素。影响普及型诊断试剂的开发和应用的主要因素也是藻胆蛋白价格太高。因此，开发APC的快速大量分离纯化技术，实现高纯度APC的低成本大量制备，对于APC在普及型诊断试剂的应用具有重要的意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法。

本发明相对现有方法，只需经过两步柱层析，就能大量得到高纯度的异藻蓝蛋白溶液。

一种快速大量制备高纯度异藻蓝蛋白的方法，步骤如下：

(1)异藻蓝蛋白的提取

将蓝藻用冻溶和低离子强度溶涨的方法解体溶解，离心分离，取上清液，即得异藻蓝蛋白浆液。

(2)异藻蓝蛋白的初步纯化

用硫酸铵沉淀法，将异藻蓝蛋白从异藻蓝蛋白浆液中沉淀出来，离心收集沉淀，再用20mM磷酸缓冲液(pH6.8～7.0)溶解并透析，除去硫酸铵，得异藻蓝蛋白粗提液。

(3)羟基磷灰石层析提取异藻蓝蛋白

使用羟基磷灰石在异藻蓝蛋白粗提液中吸附富集异藻蓝蛋白，然后用磷酸缓冲液进行洗脱，得异藻蓝蛋白溶液。这一步骤，可以实现低丰度异藻蓝蛋白的大量浓缩和富集。

(4)离子交换制备高纯度异藻蓝蛋白

根据异藻蓝蛋白在较宽的pH范围内保持稳定的特性，利用离子交换层析技术，用具有恒定的离子强度、连续pH梯度的缓冲液进行洗脱，即可以得到高纯度的异藻蓝蛋白。

所述步骤(1)中的蓝藻为螺旋藻。

所述步骤(1)异藻蓝蛋白的提取的具体操作步骤为：将蓝藻藻体按重量体积比1∶1(g/ml或kg/l)加入0.02mol/L磷酸缓冲液(pH6.8～7.0)，在-20℃下冷冻，然后在20～25℃下，融化2～3h。反复冻融2-4次后，蓝藻悬液在4℃下，8000rpm～10000rpm离心10min～15min，上清液即为异藻蓝蛋白浆液。