[发明专利]一种耐高温L－阿拉伯糖异构酶及其基因序列

说明书

技术领域

本发明涉及源自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)IAM11001的一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶及其编码的基因序列，耐高温L-阿拉伯糖异构酶工程菌的构建，以及耐高温L-阿拉伯糖异构酶的高效表达和纯化的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

D-塔格糖是近年发现的一种具有特殊保健功能的功能性甜味剂。D-塔格糖属于天然稀有糖的一种，在许多食品中都发现少量存在，如高温灭菌牛奶、奶酪、酸奶及其它奶制品等。2000年美国食品与药物管理局(FDA)确定D-塔格糖为普遍公认安全食品(GRAS)，并正式批准作为甜味剂用于食品饮料业以及医药制剂中；随后联合国粮农组织和世界卫生组织联合食品添加剂委员会(JECFA)第57次会议批准D-塔格糖作为食品添加剂；欧盟也于2003年批准D-塔格糖在欧洲上市。

目前，国内对于D-塔格糖生产的研究还处于起步阶段，国外对其研究已较为深入，生产方法主要有两种：化学法和生物法。但目前市售的D-塔格糖都是由化学法生产的。由于化学法生产一方面存在许多不利因素，如化学污染物多，碱性条件下异构化反应副产物多，分离困难等；另一方面由于消费者消费观念的转变，对天然食品的需求日益增长，因此近年来对塔格糖生产的研究集中在生物法上。研究发现L-阿拉伯糖异构酶(EC 5.3.1.4，缩写为L-AI)可以催化D-半乳糖转化为D-塔格糖，是目前生物法生产D-塔格糖最为有效的途径。D-半乳糖与D-塔格糖之间异构反应的平衡受温度影响很大，较高温度条件下(60℃以上)更有利于D-塔格糖的生成，因此耐热性的L-阿拉伯糖异构酶将具有更好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种耐高温L-阿拉伯糖异构酶及其编码的基因序列，耐高温L-阿拉伯糖异构酶工程菌的构建，以及耐高温L-阿拉伯糖异构酶的高效表达和纯化的方法。该耐高温L-阿拉伯糖异构酶在较高温条件下具有较好的活性和稳定性，对于新型功能性甜味剂D-塔格糖的工业化生产具有广泛的应用前景和经济意义。

本发明的技术方案：一种来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)IAM11001的耐高温L-阿拉伯糖异构酶，其基因核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)IAM11001巳在文献【半乳糖苷酶基因在大肠杆菌中过量表达及IPTG诱导条件，无锡轻工大学学报第21卷第5期2002年9月】中公开，本发明人承诺该微生物在20年内向公众发放。

所述的耐高温L-阿拉伯糖异构酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

所述的耐高温L-阿拉伯糖异构酶的表达方法：

(1)构建含有耐高温L-阿拉伯糖异构酶基因的表达质粒：

取嗜热脂肪芽孢杆菌IAM11001总DNA溶液3μL作为模版，以包含BamHI和XhoI的酶切位点的下列核苷酸序列作为引物，经PCR扩增得到所要的DNA片段；

引物1：5’-TGATGGATCCCATGCTGTCATTACGTCCT-3’

引物2：5’-TATATACTCGAGTTACCGCCCCCGCCAGAATAC-3’

PCR反应条件为：94℃5min，一个循环；94℃60s，56℃60s，72℃90s，三十五个循环；最后72℃延伸10min；

回收PCR产物，经限制性内切酶BamHI和XhoI进行双酶切，与经过同样双酶切的质粒pET-22b(+)，在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-22b(+)-araA；

(2)将该重组质粒转化至宿主细胞中：将重组质粒pET-22b(+)-araA转化至感受态大肠杆菌BL21中，涂布含有50μg/mL氨苄抗生素的LB固体培养基上，37℃培养18-24h得到初步阳性克隆；

(3)经抗性培养基筛选得到阳性克隆：分别挑取初步阳性克隆于5mL含有50μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养过夜，提取质粒，经限制性内切酶BamHI和XhoI酶切质粒，根据电泳结果判断具有序列表SEQ ID NO：1的DNA片段的质粒为重组质粒pET-22b(+)-araA，具有该质粒的菌落为阳性克隆，命名为工程菌BL21-AI；

对重组质粒pET-22b(+)-araA进行测序，结果表明插入片段为一个含有1491bp，编码一个由496个氨基酸组成的蛋白质。