[发明专利]抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法

权利要求书

1.一种抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法，其特征是步骤如下：

(1)抗菌抗结核植物组织的准备：采集植物的根、茎、叶、果实等组织；

(2)表面消毒与无菌检测：在无菌工作台内，将步骤(1)各部分组织用无菌水冲洗3次，采用75％酒精+0.1％升汞组合进行表面消毒，无菌水冲洗5次后，种植于水琼脂培养基中，27℃下恒温培养，表面消毒的最后一次冲洗用无菌水作为空白对照；

(3)植物内生菌的分离纯化：将步骤(2)长出的内生菌，挑取不同形态的菌落，真菌至PDA培养基，细菌至牛肉浸膏固体培养基中，划线培养至纯后，保存于相应的试管斜面中备用；

(4)内生真菌发酵：将PDA液体培养基分装在三角瓶中，用接种环挑取少许步骤(3)纯化的内生真菌菌丝于培养瓶中，置27℃摇床，150r/min，振荡培养6-7天，发酵液经4000r/min离心10-15min，取上清液；

(5)内生细菌发酵：将牛肉浸膏液体培养基分装在三角瓶中，用接种环挑取少许步骤(3)纯化的内生细菌菌落于培养瓶中，置37℃摇床，150r/min，振荡培养2-3天，发酵液经4000r/min离心10-15min，取上清液；

(6)发酵液的处理：向步骤(4)、(5)的上清液中加入95％的乙醇，混合后使乙醇浓度为75％，静置过夜，处理液4000r/min离心10-15min，取上清液，40℃减压蒸馏，真空干燥后保存于4℃冰箱备用；

(7)菌体的处理：将步骤(4)、(5)的菌体置于圆底烧瓶用等量的丙酮或乙酸乙酯水浴回流提取2h，浸提两次，4000r/min离心20min，60℃减压蒸馏，浓缩干燥后保存于4℃冰箱备用；

(8)有效抗菌菌株筛选：称取步骤(6)、(7)粉末，加入一定无菌水，使药液浓度为10mg/ml，采用改进K-B纸片法，通过测量菌圈大小，判断抑制效果；

(9)有效抗结核菌株筛选：将10mg/ml药液与一定改良罗氏培养基混合成斜面后，接种浓度为103mg/ml的人型结核分枝杆菌，接种量为0.1ml，37℃培养，观察菌落出现情况；

(10)菌种的保存：将步骤(7)筛选出的高抑制效率内生菌菌株接种于25％无菌甘油中，-80℃保存，备用。

2.根据权利要求1所述的一种抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法，其特征是步骤(2)所述的对抗菌抗结核植物组织各部分消毒时间如下：根、茎为75％酒精浸泡1min，无菌水冲洗3次，0.1％升汞漂洗1.5min；叶、果实为75％酒精浸泡1min，无菌水3次，0.1％升汞漂洗0.5-1min，水琼脂培养基组分为琼脂1.5g，蒸馏水1000ml，PH自然。

3.根据权利要求1所述的一种抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法，其特征是步骤(8)所述的采用改进K-B纸片法，是将活化好的供试菌按照麦氏比浊稀释成1.0×10⁶CFU，与冷却至50℃左右的牛肉浸膏固体培养基混合，待凝固后，每个培养基平面放四个直径为5mm的无菌纸片，将配制好的药液按15ul的量打入纸片，置37℃培养箱培养。

4.根据权利要求1所述的一种抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法，其特征是步骤(9)所述的改良罗氏培养基的组成为：味精(谷氨酸钠95％以上)7.2g，磷酸二氢钾2.4g，硫酸镁0.24g，柠檬酸镁0.6g，甘油12mL，蒸馏水600mL，马铃薯淀粉30g，全卵液1000mL，2％孔雀绿20mL。