[发明专利]抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物药物筛选技术领域，具体涉及抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法。

背景技术

近年来，由于植物资源的匮乏，而植物内生菌能够产生某些特殊生理活性物质，因此国内外药学家们对内生菌的研究广泛关注。在植物内生菌的分离过程中，用到的消毒方法主要有物理消毒法和化学消毒法，化学消毒剂的选择上存在几种组合：75％酒精；75％酒精+升汞；75％酒精+次氯酸钠。因为消毒不彻底，所以选用物理消毒法和单独选择酒精作为消毒剂的较少。后两者组合是常用的，国外学者多采用75％酒精+次氯酸钠这个组合，主要考虑到次氯酸钠，较之升汞，无毒。但这个组合通常不如75％酒精+升汞这个组合消毒彻底，而且对外植体处理时间较长，也容易引起内生菌死亡。国内学者常使用75％酒精+升汞这一消毒剂组合进行表面消毒，但因研究者的喜好不同，宿主植物的种类以及宿主组织类型的不同，这个组合也不尽相同。因此，一个快速有效的化学消毒组合，对内生菌的分离是至关重要的。

植物内生菌的抗菌抗肿瘤活性，许多科学家进行了深入的研究，并得到了一系列活性单体，而通过优化的表面消毒方法，研究香樟、狭叶十大功劳木等植物内生菌的抗菌抗结核活性，通过发酵获得对人畜病原菌及人型结核分枝杆菌具有抑制作用的次生代谢产物，从而获得抗菌抗结核活性菌株，这在内生菌研究领域还未受到过多关注。

发明内容

本发明的目的是提出一种通过优化的化学方法从抗菌抗结核植物组织中，分离筛选出次生代谢产物对人畜病原菌及人型结核分枝杆菌有明显抑制作用的内生菌的方法，使植物内生菌资源得到更有效的利用，从而实现从微生物中筛选抗菌抗结核菌株，从微生物发酵产物中提取抗菌抗结核物质。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案得以实现。

1、一种抗菌抗结核植物内生菌的分离筛选方法，其特征是步骤如下：

(1)抗菌抗结核植物组织的准备：采集植物的根、茎、叶、果实等组织；

(2)表面消毒与无菌检测：在无菌工作台内，将步骤(1)各部分组织用无菌水冲洗3次，采用75％酒精+0.1％升汞组合进行表面消毒，无菌水冲洗5次后，种植于水琼脂培养基中，27℃下恒温培养。表面消毒的最后一次冲洗用无菌水作为空白对照；

(3)植物内生菌的分离纯化：将步骤(2)长出的内生菌，挑取不同形态的菌落，真菌至PDA培养基，细菌至牛肉浸膏固体培养基中，划线培养至纯后，保存于相应的试管斜面中备用；

(4)内生真菌发酵：将PDA液体培养基分装在三角瓶中，用接种环挑取少许步骤(3)纯化的内生真菌菌丝于培养瓶中，置27℃摇床，150r/min，振荡培养6-7天，发酵液经4000r/min离心10-15min，取上清液；

(5)内生细菌发酵：将牛肉浸膏液体培养基分装在三角瓶中，用接种环挑取少量步骤(3)纯化的内生细菌菌落于培养瓶中，置37℃摇床，150r/min，振荡培养2-3天，发酵液经4000r/min离心10-15min，取上清液；

(6)发酵液的处理：向步骤(4)(5)的上清液中加入95％的乙醇，混合后使乙醇浓度为75％，静置过夜，处理液4000r/min离心10-15min，取上清液，40℃减压蒸馏，真空干燥后保存于4℃冰箱备用；

(7)菌体的处理：将步骤(4)(5)的菌体置于园底烧瓶用等量的丙酮或乙酸乙酯水浴回流提取2h，浸提两次，4000r/min离心20min，60℃减压蒸馏，浓缩干燥后保存于4℃冰箱备用；

(8)有效抗菌菌株筛选：称取步骤(6)(7)粉末，加入一定无菌水，使药液浓度为10mg/ml，采用改进K-B纸片法，通过测量菌圈大小，判断抑制效果；

(9)有效抗结核菌株筛选：将10mg/ml药液与一定改良罗氏培养基混合成斜面后，接种浓度为103mg/ml的人型结核分枝杆菌，接种量为0.1ml。37℃培养，观察菌落出现情况；

(10)菌种的保存：将步骤(7)筛选出的高抑制效率内生菌菌株接种于25％无菌甘油中，-80℃保存，备用。

本发明步骤(2)对抗菌抗结核植物组织各部分消毒时间如下：根、茎75％酒精浸泡1min，无菌水冲洗3次，0.1％升汞漂洗1.5min；叶、果实75％酒精浸泡1min，无菌水3次，0.1％升汞漂洗0.5-1min。水琼脂培养基组分为琼脂1.5g，蒸馏水1000ml，PH自然。