[发明专利]一种同时检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1、一种同时检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B₁的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征是由96或48孔包被板(1)，缓冲液(2)，含赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B₁的标准(3)，鼠抗赭曲霉毒素A的抗体冻干品(4)，兔抗黄曲霉毒素B₁的抗体冻干品(5)，钐标记的羊抗鼠抗体(6)，铕标记的羊抗兔抗体(7)，洗涤液(8)和增强液(9)所组成。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其中的包被板(1)包被固相抗原，用50mmol/LpH9.6Na₂CO₃-NaHCO₃的缓冲液将赭曲霉毒素A-牛血清蛋白OTA-BSA、黄曲霉毒素B₁-牛血清蛋白AFB₁-BSA稀释至各自终浓度都为10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板各孔加100μL，4℃放置过夜，弃去包被液，冲洗三次，加150μL含3g/LBSA的上述缓冲液封闭，4℃放置过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-20℃冷冻保存。

3、根据权利要求1所述的试剂盒，其中的含赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B₁的标准(3)，分别从OTA、AFB₁纯品中稀释后再混合得到，稀释液为甲醇∶水＝3∶7，共6瓶，每瓶中的OTA浓度依次为：0ng/mL，0.1ng/mL，1ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，及AFB₁浓度依次为：0ng/mL，0.05ng/mL，0.5ng/mL，1ng/mL，10ng/mL，100ng/mL。

4、根据权利要求1所述的试剂盒，其中的鼠抗赭曲霉毒素A的抗体冻干品(4)，为由赭曲霉毒素A-血蓝蛋白OTA-KLH免疫小鼠得到的抗赭曲霉毒素A的单克隆抗体。

5、根据权利要求1所述的试剂盒，其中的兔抗黄曲霉毒素B₁的抗体冻干品(5)，为由黄曲霉毒素B₁-血蓝蛋白AFB₁-KLH免疫家兔得到的抗黄曲霉毒素B₁的多克隆抗体。

6、根据权利要求1所述的试剂盒，其中的钐标记的羊抗鼠抗体(6)，将购得的羊抗鼠抗体，经PD-10柱转换缓冲条件至pH9.0，收集蛋白峰，取已转换的羊抗鼠抗体加入Sm³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸，反应过夜，反应液经柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。

7、根据权利要求1所述的试剂盒，其中的铕标记的羊抗兔抗体(7)，将购得的羊抗兔抗体，经PD-10柱转换缓冲条件至pH9.0，收集蛋白峰，取已转换的羊抗兔抗体加入Eu³⁺-N₂-[p-异氰酸-苄基]-二乙烯三胺四乙酸，反应过夜，反应液经柱层析，收集蛋白峰，稀释、分装备用。

8、根据权利要求1所述的试剂盒，其中的缓冲液(2)：含8mmol/L NaCl、0.1％BSA、50μmol/L二乙烯三胺五乙酸、0.1mL/L Tween-80和0.1％NaN₃的50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液；洗涤液(8)：14.5mmol/L NaCl、0.2mL/LTween-80和0.2％NaN₃的50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液；增强液(9)：1升pH3.2邻苯二甲酸氢钾缓冲液，其中含15μmol β-萘甲酰三氟丙酮，50μmol三正辛基氧化膦和1mL曲拉通X-100。

9、一种用权利要求1所述的试剂盒同时检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B₁的方法，其特征是取包被有OTA-BSA和AFB₁-BSA的微孔包被板，加入OTA、AFB₁标准或处理好的样品到各自的微孔中，再加入抗OTA、AFB₁抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加钐标记的羊抗鼠抗体和铕标记的羊抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加增强液振荡后分别测量铕和钐的荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的OTA和AFB₁含量。

10、根据权利要求9所述的同时检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B₁的方法，其特征是：取包被有OTA-BSA和AFB₁-BSA的微孔包被板，加入50μL的OTA、AFB₁标准或处理好的样品到各自的微孔中，加25μL以缓冲液(2)作稀释剂，1∶10稀释OTA抗体，加25μL以缓冲液(2)作稀释剂，1∶10稀释AFB₁抗体，25-37℃振荡0.5-1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液(2)1∶10稀释的50μL Eu³⁺-羊抗兔抗体，加以缓冲液(2)1∶10稀释的50μL Sm³⁺-羊抗鼠抗体，25-37℃振荡0.5-1小时，用洗涤液洗六次，加200μL增强液振荡5分钟后分别测量钐和铕荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的OTA和AFB₁含量。