[发明专利]从鱼类肠系膜脂肪组织中克隆鱼类ob基因的方法

权利要求书

1、从鱼类肠系膜脂肪组织中克隆鱼类ob基因的方法，首先提取鱼类的肠系膜脂肪组织总核糖核酸，其特征在于：

(1)、取鱼肠系膜脂肪组织总核糖核酸，采用一步法逆转录-聚合酶链反应，用一对特异性引物P1、P2，所述特异性引物P1、P2结构如下：

P1：GAGGAATTCGTGCCTATCCAGGAT  GAATTC为EcoRI酶切位点，

P2：GACAAGCTTCTCAGCATTAGGGCG  AAGCTT为HindIII酶切位点，

从鱼肠系膜脂肪组织总核糖核酸中扩增取得此鱼ob基因片段；

(2)并将此ob基因片段克隆至pMD18-T载体中，经酶切鉴定和聚合酶链反应鉴定后，进行序列测定，获得克隆的鱼类ob基因。

2、根据权利要求1所述的从鱼类肠系膜脂肪组织中克隆鱼类ob基因的方法，其特征在于：

所述一步法逆转录-聚合酶链反应的具体操作如下：

按TaKaRa公司试剂盒说明书调制50ul反应体系如下：

10×一步法PCR缓冲液                    5uL

25mmol/L氯化镁                         10uL

10mmol/L三磷酸脱氧核苷酸混合溶液       5uL

40U/ul RNA酶抑制剂                     1uL

5U/ul禽反转录酶                        1uL

DNA聚合酶                              1uL

20umol/L上游引物P1                     1uL

20umol/L下游引物P2                     1uL

肠系膜脂肪组织总核糖核酸               1uL；

P1：GAGGAATTCGTGCCTATCCAGGAT  GAATTC为EcoRI酶切位点，

P2：GACAAGCTTCTCAGCATTAGGGCG  AAGCTT为HindIII酶切位点，

反应参数为：①50℃反转录30min，94℃预变性5min；②进入聚合酶链反应循环，其条件为94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，30个循环；③72℃延伸10min，4℃保存；一步法逆转录-聚合酶链反应产物用0.8％的琼脂糖电泳进行检测，并对预期大小的特异性扩增片段用DNA回收试剂盒进行回收，获得特异性扩增DNA片段，即扩增取得鱼的ob基因片段。