[发明专利]从鱼类肠系膜脂肪组织中克隆鱼类ob基因的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种克隆技术，确切地说是从含有微量ob基因的鱼类总RNA中克隆出鱼类ob基因的方法。

背景技术

1950年，Ingalls等发现一个基因的隐性突变可以导致肥胖，它将该基因命名为肥胖基因(obese gene，ob基因)，第一次出现了ob基因的概念。1994年底zhang等利用定位克隆技术克隆出了小鼠肥胖基因，并将该基因定位于6号染色体上。自从人和小鼠的ob基因克隆后，ob基因一直成为国内外研究的热点。ob基因编码的蛋白质称为瘦素(leptin)，是反映体内脂肪含量的重要信号因子，瘦素(leptin)主要作用于下丘脑的特异受体，通过下丘脑进行摄食调控和维持能量代谢的平衡，瘦素(leptin)还对机体的免疫应答，繁殖功能，神经内分泌等功能具有重要的作用，具有广泛的生物学效应。现在已经克隆出了人、鼠、猪等动物的ob基因，并对其生物功能和表达特点进行了深入的研究。而有关鱼类的ob基因及其功能的研究报道相对较少。鱼类品种繁多，不同品种的鱼类具有不同的摄食习性，并且鱼类体内脂肪的含量、摄食量以及饱食感与其摄食习性均有较大程度的差异，而对鱼类ob基因的研究将有利于阐明不同品种鱼类的摄食习性与机体的脂肪含量、摄食量以及饱食感之间的关系，对研究鱼类摄食调控的分子机理具有重要意义。

鱼类是一种变温动物，其生存环境与哺乳动物有很大的不同，鱼类ob基因与哺乳动物的ob基因存在较大的差异(Kurikawa et al.，2005)；鱼类脂肪组织的含量相对于其它动物较少，且鱼类脂肪组织中提取的总RNA含量亦非常低，因此通过克隆其它动物ob基因的方法较难克隆出鱼类ob基因。

先前设计的引物虽然能克隆出鱼类ob基因，但由于引物碱基数量较少，与鱼类ob基因保守序列同源性不高，因此在进行一步法逆转录-聚合酶链反(RT-PCR)应时，对反应参数及核糖核酸(RNA)的质量要求非常严格，试验成功率低，一般克隆出一条鱼的ob基因需要2-3个月，时间较长。

发明内容

本发明全新设计一对引物，改进技术方案，能从含有微量ob基因的鱼类总RNA中，克隆出鱼类ob基因。

本发明从鱼类肠系脂肪组织中克隆鱼类ob基因的方法，包括下述具体步骤：

根据Genbank上公布的人、猪、鼠等动物的肥胖基因cDNA编码区序列的相似性设计一对特异性引物P1、P2，结构如下。

P1：GAGGAATTCGTGCCTATCCAGGAT  GAATTC为EcoRI酶切位点。

P2：GACAAGCTTCTCAGCATTAGGGCG  AAGCTT为HindIII酶切位点。

从鱼类的肠系膜脂肪组织(RNA)中扩增出了不同鱼的ob基因片段，并将ob基因分别克隆至pMD18-T载体中，经酶切鉴定和聚合酶链反应(PCR)鉴定后，进行序列测定，达到能够高效克隆出鱼类ob基因的目的。

本发明的有益技术效果体现在：①本发明中的引物设计是在试验中逐步完善的，较先前设计的鱼类ob基因引物有较大改进，本发明设计的引物与鱼类ob基因保守序列有较高的同源性，反应的成功率较先前有所提高，一般成功克隆出一条鱼的ob基因只需要20-30天的时间；且引物P1、P2含有EcoRI、HindIII两个酶切位点，这两个酶切位点为常用酶切位点，许多质粒载体中均含有该酶切位点，通过酶切后可与相应的质粒载体连接，对鱼类ob基因的相关研究提供了便利；②本发明中的引物P1、P2引入不同的酶切位点，通过双酶切后可以与相应载体进行定向连接，有利于鱼类ob基因序列测定、蛋白质的表达、功能等相关研究；③本发明能够从变温动物鱼类中克隆出ob基因，而此前国内学者方铃等与日本学者合作，未能克隆出鱼类ob基因；Kurokawa等(2005)根据已知动物的ob基因序列，克隆出红鳍东方魨ob基因cDNA序列，其所用引物等与本发明不同。

附图说明

图1是鳙、鲢肠系膜脂肪组织总RNA电泳图。

图2是鳙、鲢ob基因的RT-PCR扩增图。

图3是鳙、鲢ob基因的重组质粒pYong-ob和pLian-ob通过EcoRI+HindIII双酶切鉴定图。

具体实施方式

下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地说明。

实施例：

一、提取鱼类肠系膜脂肪组织总核糖核酸(RNA)