[发明专利]一种α－环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达

权利要求书

1、一种α-环糊精葡萄糖基转移酶，缩写为α-CGT酶，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

2、一种编码权利要求1所述的α-环糊精葡萄糖基转移酶的基因，缩写为cgt基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3、一种如权利要求2所述的α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的表达方法，其特征是由软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01总DNA获得cgt基因SEQ ID NO：1，cgt基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，实现cgt基因的高效表达；

(1)软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-0 1总DNA的提取：

P.macerans JFB05-01菌株在LB液体培养基中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于500μL Tris-EDTA缓冲液，加入15μL溶菌酶，37℃下保温30min，再加入5μL RNA酶，37℃下保温30min，加入30μL10％十二烷基硫酸钠溶液和15μL蛋白酶K，37℃下保温60min，加入100μL 5M的NaCl溶液和80μL十六烷基三甲基溴化铵，65℃下保温20min，用700μL的酚∶氯仿∶异戊醇体积比25∶24∶1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用700μL的氯仿∶异戊醇体积比24∶1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用1400μL体积的冰异戊醇混合，-20℃沉淀30min，10000rpm离心，沉淀加200μL70％乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即得到P.maceransJFB05-01总DNA；

(2)α-CGT酶编码基因的克隆：

以P.macerans JFB05-01总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点Nco I和EcoRI，PCR扩增cgt基因；

引物1：5’-CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC-3’

引物2：5’-CTCgAgAgAATTCggATTTTgCCAgTCCAC-3’

PCR反应在50μL体系中进行：5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，模板DNA 1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

反应条件为：在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，扩增得到2061bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100mg/L氨苄青霉素的LB平板，经37℃培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8～10h后提取质粒，命名为cgt/pMD18-T simple，将此质粒进行序列测定；

(3)cgt基因的改造：

以cgt/pMD18-T simple为模板进行定点突变PCR，以消除基因内部的Nco I位点，设计引物： 

引物3：5’-CAATgTgggTCCCACAATgggCCAgCC-3’

引物4：5’-ggCTggCCCATTgTgggACCCACATTg-3’

PCR反应在50μL体系中进行，5×PCR缓冲液10μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，10μmol/L上下游引物各1μL，模板cgt/pMD18-T simple 1μL，Taq酶0.5μL，加双蒸水至总体系50μL；

反应条件为在94℃变性4min后开始循环，然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸5min，共35个循环后，再于72℃延伸10min，将PCR产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化后的菌体涂布100mg/L氨苄青霉素LB平板，培养挑选单菌落接入100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基，经37℃培养过夜，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定；

(4)cgt基因在表达载体上的构建：

用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pelB信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和扩增的cgt基因进行Nco I和EcoR I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，经37℃培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的cgt/pET20b(+)质粒；

(5)大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌：

将质粒cgt/pET20b(+)热击转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，再100mg/L氨苄青霉素-LB平板上经37℃培养过夜，挑选含质粒cgt/pET20b(+)的E.coli BL21(DE3)转化子在LB培养基中37℃液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基，30℃培养至OD达0.6后用终浓度0.01μM异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导，降温至25℃培养，90h时产α-CGT酶达22.5U/mL；

(6)重组α-CGT酶的纯化和特性：

将上述α-CGT酶发酵液于4℃、10000rpm离心20min除菌体；上清液中加入70％固体硫酸铵盐析过夜，4℃、10000rpm离心20min，取沉淀物用适量含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH 7.4的缓冲液A溶解，并在缓冲液A中透析过夜后，通过0.22μm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A、含20-480mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A洗脱，流速1mL/min，检测波长为280nm，分部收集含α-CGT酶酶活的洗脱液；活力组分在pH＝6、50mM磷酸钠缓冲液中透析过夜后，得纯化α-CGT酶酶制品。