[发明专利]一种α－环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达

说明书

技术领域

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶(简称α-CGT酶)基因的克隆与表达，本发明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说涉及一种编码软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01α-CGT酶的DNA序列及其表达。

背景技术

CGT酶是一个多功能型的酶，它能催化四种不同的反应：三种转糖基化反应(歧化反应、环化反应和偶合反应)和水解反应。CGT酶通过环化反应能利用淀粉生产环糊精，这是其工业应用的基础。除了通过环化反应生产环糊精，最近也用CGT酶催化偶合和歧化反应，转移供体如淀粉或环糊精上的低聚糖到各种受体分子上，得到各种特殊的低聚糖。通过催化不同受体分子的糖基化反应，对诸如甜菊苷、橘皮苷、芸香苷、维生素C、鼠李糖、抗坏血酸等进行糖基化，能显著提高受体分子的功能性、水溶性、对化学物质的稳定性。另外，CGT酶极限糊精的应用也被发现，它可应用于造纸工业中的表面施胶和涂布，能改善纸张的书写性能并具有光滑且适于印刷的表面。CGT酶也可用来处理生面团，通过CGT酶的歧化反应，能增加该面团所制作的焙烤产品的体积。

生产CGT酶的微生物种类众多，有芽孢杆菌、放线菌、微球菌、短杆菌、曲霉、古细菌等。现在工业上生产环糊精所使用的CGT酶主要来自芽孢杆菌属。根据环化反应在起始阶段所生成环糊精的主要类型不同，CGT酶可分为α、β和γ型CGT酶，即α-、β-和γ-CGT酶。大部分CGT酶为β型。

目前，许多CGT酶已经得到了纯化，相应的CGT酶的编码基因(cgt基因)得到了克隆。由于能分泌CGT酶的野生菌株的生产能力普遍较低，为了克服野生菌株的低生产能力，重组大肠杆菌在工业化生产CGT酶中已经在国外得到了极大的重视。目前，诱导型启动子P_lac、P_tac、P_trp和P_L已经广泛应用于在重组大肠杆菌中过量生产CGT酶，但是有关利用适宜载体和宿主对CGT酶进行胞外表达的报道不多，重组CGT酶大多是作为一种包涵体在细胞内部进行积累的，因此，这种包涵体的活化需要复杂的变性和重折叠等关键过程，不利于工业化生产。在国内，CGT酶的克隆与表达迄今为止鲜有报道，国内大部分研究者主要致力于提高原始菌株的酶产量。

环糊精是由六个以上葡萄糖连结而成的具有环状疏水圆锥形结构的低聚糖非还原性化合物系列，其中最常用的是α-、β-、γ-环糊精，它们分别由6、7、8个葡萄糖单元构成。目前，环糊精的工业化生产均采用酶法合成，即在CGT酶催化作用下，通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于环糊精能与许多客体分子形成包合物，从而改变客体分子的物理和化学性质如溶解度、稳定性等，因此在食品、医药、农业、纺织、环保、化妆品、生物技术和分析化学等领域具有广泛的应用。国际市场对环糊精的年需求已达到10万吨以上，国内也已接近万吨；仅制备医药片剂一项需求就达数千吨，而目前环糊精总产量仅万吨左右，国内仅700余吨，而且绝大部分是β-环糊精，同时有少量的α-环糊精和混合环糊精。随着应用领域的不断拓展，环糊精的需求量一直在逐年大幅度增长，目前，环糊精的年增长率达到20％～30％。环糊精在各个工业领域中的应用比例大致为：食品工业80％、医药10％、农药5～10％。

和β-环糊精、γ-环糊精结构相比，α-环糊精最大的特点是具有更小的环结构和更小的空腔，因此具有独特的性质和特有的用途。一般来说，α-环糊精可以复合具有低分子量的分子或者包接脂肪族的侧链。在食品工业上，能作为天然色素、香料和维生素等的载体；能稳定食品中的某些成分，防止其挥发，抗氧化、抗光和热分解等；除去食品中的臭味和苦涩味；使某些食品形成长期稳定的乳状液等。特别值得注意的是，α-环糊精具有抗过敏作用，可抑制IgE抗体，一些含α-环糊精的保健食品已经面市。食用该类产品可消除过敏，预防支气管哮喘、过敏性皮炎、鼻炎等症；α-环糊精也是一种难消化膳食纤维，食后有降血糖的作用。目前，由于β-环糊精的工业化生产比较成熟，价格较低，因此应用面最广，但是，许多研究证实，在一些场合α-环糊精的使用效果明显好于β-环糊精。但由于α-环糊精的价格较高，限制了其广泛的应用。