[发明专利]突变型人白介素－2与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备

权利要求书

1、突变型人白介素-2(IL2m)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。其特征是包括与优化突变型人白介素-2至少85％序列同源的第二区和与人血清白蛋白至少85％序列同源的第二区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第一区；所述与优化突变型人白介素-2同源的第二区位于融合蛋白的C末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，中间不加任何连接肽；或所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与优化突变型人白介素-2同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。

2、根据权利要求1所述的突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白包括与优化突变型人白介素-2至少95％序列同源的第二区和与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区。

3、根据权利要求1所述的突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白的第二区由人血清白蛋白部分结构域组成或经结构域重排后的人血清白蛋白组成。

4、根据权利要求1所述的突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白包括与突变型人白介素-2氨基酸残基序列相同的第二区和与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同的第一区，或上述二区的功能等同物。

5、根据权利要求4所述的突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白。其特征在于所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。

6、根据权利要求1所述的突变型人白介素-2(IL2m)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白的制备。其特征是人工合成突变型人白介素-2(IL2m)cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA利用重叠PCR技术，连接IL2m cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-IL2m cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；利用毕赤酵母分泌型表达载体将HSA-IL2m cDNA融合基因整合到宿主的染色体中进行表达。

(1)IL2m cDNA的克隆

由上海生工生物工程技术服务有限公司人工合成IL2m cDNA(399bp)，将其克隆到载体PUC57上，插入位点为Sma I，受体菌为大肠杆菌DH5α菌株。

(2)HSA cDNA的克隆

利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：

P1：5’-AGGTCGACGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’

P2：5’-GCCAAGCTTTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’

PCR反应体系：10μmol/L的P1和P2引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，循环30次；72℃延伸10分钟。

琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目的片断。纯化好的目的片断和载体pBlu2KSP分别经Sal I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR片段胶回收试剂盒回收目的片断。T₄ DNA连接酶连接经双酶切的HSA cDNA和载体pBlu2KSP，连接产物转化大肠杆菌XL-1-Blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，Sal I和Hind III双酶切鉴定阳性克隆，并对重组质粒Sal I和Hind III双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlu2KSP-HSA，阳性重组子命名为XL-1-Blue/pBlu2KSP-HSA。

(3)IL2m cDNA和HSA cDNA融合基因的克隆

①IL2m cDNA的PCR扩增，所用引物如下：

HI1：5’-CAAGCTGCCTTAGGCTTAGCACCTACTTCAAGTTCTAC-3’

HI2：5’-AGCGGCCGCTTAAGTCAGTGTTGAGATGATGC-3’

PCR反应体系：10μmol/L的HI1和HI2引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，质粒模板PUC57-IL2m 1ng，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸30秒，循环30次；72℃延伸10分钟。

②HSA cDNA的PCR扩增，所用引物如下：

HI3：5’-GGAATTCAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGT-3’

HI4：5’-GTAGAACTTGAAGTAGGTGCTAAGCCTAAGGCAGCTTG-3’

PCR反应体系：10μmol/L的HI 3和HI 4引物各1.5μl，2.5mmol/L的dNTP 4μl，10×pfu Buffer 5μl，5U/μl的pfu DNA聚合酶0.5μl，质粒模板pBlu2KSP-HSA 1ng，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，循环30次；72℃延伸10分钟。

③重叠PCR技术融合IL2m cDNA和HSA cDNA

将IL2m的PCR扩增产物和HSA的PCR扩增产物分别稀释10倍，再以1∶10比例混合后作为模板，于50ul反应体系中加入2×Pfu PCR MasterMix 25ul，混合好的模板25μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，循环15次；72℃延伸10分钟。

以该PCR产物为模板，50μl的反应体系中加入10μmol/L的引物HI2和HI3各1.5μl，2×Pfu PCRMasterMix 25ul，模板4ul，加双蒸水补齐50μl。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，65℃退火1分钟，72℃延伸4分钟，循环35次；72℃延伸10分钟。

琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出2.2kb的目的片段。纯化的重叠PCR产物和载体pBlu2KSP，分别经EcoR I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，用PCR片段胶回收试剂盒回收IL2m-HSA基因和载体pBlu2KSP。用T₄ DNA连接酶连接两回收片段，连接产物转化大肠杆菌XL-1-Blue感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，EcoR I和Not I双酶切鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoR I和Not I双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlu2KSP-HSA-IL2m，阳性重组子命名为XL-1-Blue/pBlu2KSP-HSA-IL2m。

(4)融合蛋白IL2m-HSA的酵母表达系统的构建

取一支冻存的XL-1-Blue/pBlu2KSP-HSA-IL2m，接种到20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。提取的质粒pBlu2KSP-HSA-IL2m和酵母表达载体pPIC9K，分别经EcoR I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，用PCR片段胶回收试剂盒回收HSA-IL2m基因和载体pPIC9K。用T₄ DNA连接酶连接两回收片段，连接产物转化大肠杆菌XL-1-Blue感受态细胞，转化物涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取长出的菌落，接种于20ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。采用PCR扩增，EcoR I和Not I双酶切鉴定阳性克隆。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pPHI2m.阳性重组子命名为XL-1-Blue/pPHI2m。

提取XL-1-Blue/pPHI2m中的质粒，经Sal I单酶切，DNA胶回收试剂盒回收后，电击转化毕赤酵母GS115，提取重组毕赤酵母基因组DNA，PCR扩增鉴定，阳性重组子命名为GS115/pPHI2m。

(5)融合蛋白HSA-IL2m的表达

将GS115/pPHI2m接种至装有10ml BMGY的50ml三角瓶中，250rpm，30℃培养24小时，离心收集菌体，将收集到的菌体接种至装有3ml BMMY的50ml三角瓶中，每24小时补加一次甲醇至终浓度3％，诱导3天，离心收集上清，进行SDS-PAGE验证，Western杂交鉴定融合蛋白HSA-IL2m分子的IL-2及HSA免疫源性。