[发明专利]突变型人白介素－2与人血清白蛋白的融合蛋白及其制备

说明书

技术领域

突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。

背景技术

白介素-2(Interleukin-2，IL-2)是机体免疫应答和免疫调节的核心物质，具有抗肿瘤、抗病毒和增强机体免疫能力的作用。它也是一类造血因子，重组的白介素-2在临床上用于因化疗而造成的血小板减少症状。同时，他对T细胞的免疫活性和强度都起到至关重要的调控作用。白细胞介素-2是1976年Morgan等首先在外周血淋巴细胞中发现的。其分子量是14.5KD。由133个氨基酸残基组成；含有1对二硫键(C58-C105)，但是在125位同样有一个半胱氨酸，所以有错配的可能，如果错配，白介素-2的活性就会有非常大的损失。通常的白介素-2在体内的半衰期非常短，只有10分钟左右，且易被肾小球滤过。为了达到治疗效果，一般需要频繁大剂量用药，频繁大剂量用药不仅增加了病人的痛苦和治疗费用，而且容易产生毒副作用。为了克服上述缺点，可以对白介素-2加以修饰，以延长其半衰期。主要方法有做成缓释剂型、利用化学手段修饰(如用PEG，葡聚糖修饰)、利用基因工程手段，对其氨基酸序列进行突变增加其生物稳定性(突变型人白介素-2，IL2m)或将其与其它大分子蛋白融合。所以本发明将突变型人白介素-2(IL2m)与人血清白蛋白(HSA)融合。

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分在血浆中的浓度为40mg/ml(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 261：6747-6757)，它除了具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和/或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过结合这些配体，HSA可以调节激素活性、内源性和/或外源性物质的毒性和药物的利用度(Ji-Sook Ha et al.，Biochimica et Biophysica Acta，2003 640：119-128)。David S.Park等构建的Half HSA(截取HSA的前297个氨基酸残基)具有野生型HSA相应区类似的二级结构，同时保留了野生型HSA结合甲状腺素和甲状腺素类似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，1999 48：169-174)，细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein结构，包括18个氨基酸残基的信号肽和6个氨基酸残基前肽的原肽。信号肽和前肽在转运和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa。通常情况下，HSA为非糖基化蛋白，然而有的突变体中也存在N-连接糖基化(见Uniprot中的proteinALBU_HUMAN)。Peters的观点认为进化出大分子蛋白的优点是减小其在内循环时经肾排泄(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，1985 37：161-245)。HSA的分子量相对较大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其血浆半衰期在20天左右。

发明内容

本发明的目的是提供一种突变型人白介素-2与人血清白蛋白的融合蛋白的制备方法及产品。本发明的融合蛋白在保持了人白介素-2的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。

本发明的技术方案：人工合成IL2m cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；利用重叠PCR技术，连接IL2m cDNA和HSA cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-IL2m cDNA融合基因插入到克隆载体pBlu2KSP中保存。HSA-IL2m cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主细胞中进行表达。

IL2m cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，HSA-IL2m cDNA融合基因的克隆，融合蛋白HSA-IL2m重组酵母构建和融合蛋白HSA-IL2m的表达的步骤详见具体实施方法。