[发明专利]人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白及其制备

权利要求书

1、人血清白蛋白(HSA)与人胰岛素C肽(CP)的融合蛋白。其特征是包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列第一区和与人胰岛素C肽至少85％序列同源的第二区；所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人胰岛素C肽同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人胰岛素C肽同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。

2、根据权利要求1所述的人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白包括与人血清白蛋白至少95％序列同源的第一区和与胰岛素C肽至少95％序列同源的第二区。

3、根据权利要求1所述的人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白的第一区由人血清白蛋白部分结构域组成或经结构域重排后的人血清白蛋白组成。

4、根据权利要求1所述的人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白。其特征在于所述融合蛋白包括与人血清白蛋白氨基酸残基序列相同第一区和与人胰岛素C肽氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能等同物。

5、根据权利要求4所述的人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白。其特征在于所述功能等同物是在不改变所述融合蛋白特性的前提下，对融合蛋白个别氨基酸残基的取代、缺失或加入得到的多肽。

6、根据权利要求1所述的人血清白蛋白(HSA)与人胰岛素C肽(CP)的融合蛋白的制备。其特征是人工合成CP cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；同框酶切连接HSA cDNA和CP cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-CP cDNA融合基因插入到克隆载体中保存；利用毕赤酵母分泌型表达载体将HSA-CP cDNA融合基因整合到宿主的染色体中进行表达。

(1)CP cDNA的克隆

由上海海毅生物技术有限公司人工合成CP cDNA(93bp)，将其克隆到载体pMD18T上，插入位点为EcoR V，受体菌为大肠杆菌DH5α菌株。

(2)HSA cDNA的克隆

利用PCR从人胎肝cDNA文库中扩增出HSA cDNA，所用的引物为：

PH1：5’-CAGCGAATTCGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTC-3’

PH2：5’-CACCGCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTT-3’

PH1下划线部分为EcoR I酶切位点，PH2下划线部分为NotI酶切位点

PCR反应体系：10μmol/L的PH1和PH2引物各1.5μL，2.5mmol/L的dNTP 4μL，10×pfu Buffer 5μL，5U/μL的pfu DNA聚合酶0.5μL，人胎肝cDNA文库1μg，加双蒸水补齐50μL。PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸3min，循环30次；72℃延伸10分钟。

琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在加样泳道出现目标条带，用PCR片段胶回收试剂盒纯化出1.8kb的目的片断。纯化好的目的片断和载体pBlu2KSP分别经EcoR I和NotI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR片段胶回收试剂盒回收目的片断。T4 DNA连接酶连接经双酶切的HSA cDNA和载体pBlu2KSP，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，EcoR I和NotI双酶切鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoR I和NotI双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为DH5α/pBlu2KSP-HSA，阳性重组子命名为DH5α/pBlu2KSP-HSA。

(3)含HSA cDNA和CP cDNA融合基因的克隆载体构建

①构建的pBlu2KSP-HSA载体在HSA基因的C末端含有Saul I和Not I的酶切位点，可通过用在CP基因的上下游引物中分别引入Saul I和Not I酶切位点，设计使CP基因经Saul I和Not I双酶切后与经Saul I和Not I双酶切的pBlu2KSP-HSA同框连接。

②CP cDNA的PCR扩增，所用引物如下：

PC1：5’GAAACCCTTAGGCTTAGAAGCTGAGGACTTGCAAGTTGGTC 3’

PC2：5’GTTGCGGCCGCTTATTGAAGAGAACCTTCCAAAGCCA 3’

其中PC1下划线部分为Saul I酶切位点，PC2下划线部分为Not I酶切位点

PCR反应体系：10μmol/L的PC1和PC2引物各1.5μL，2.5mmol/L的dNTP 4μL，10×pfu Buffer 5μL，5U/μL的pfu DNA聚合酶0.5μL，质粒模板pMD18T-CP 1ng，加双蒸水补齐50μL。PCR反应程序：95℃预变性5分钟；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。

③同框酶切连接HSA cDNA和CP cDNA融合基因

琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，在100bp地方出现目标片段，用PCR片段胶回收试剂盒纯化PCR扩增得到的CP基因。用Saul I和Not I双酶切纯化的PCR产物和pBlu2KSP-HSA载体，用PCR片段胶回收试剂盒回收CP基因和pBlu2KSP-HSA载体。用T4 DNA连接酶连接两回收片段后转化大肠杆菌DH5α，转化物涂布于含有X-gal、IPTG和100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取白色菌落，接种于20mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取转化质粒。采用PCR扩增，EcoR I和Not I双酶切鉴定阳性克隆，并对重组质粒EcoR I和Not I双酶切位点间区域进行DNA测序。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pBlu2KSP-HSA-CP，阳性重组子命名为DH5α/pBlu2KSP-HSA-CP。

(4)融合蛋白HSA-CP的酵母表达系统的构建

取一支冻存的DH5α/pBlu2KSP-HSA-CP，接种到20mL含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。提取的质粒pBlu2KSP-HSA-CP和酵母表达载体pPIC9K，分别经EcoR I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，用PCR片段胶回收试剂盒回收基因HSA-CP和载体pPIC9K。用T4 DNA连接酶连接两回收片段，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化物涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板，37℃培养过夜。挑取长出的菌落，接种于20mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜，用质粒抽提试剂盒提取质粒。采用PCR扩增，EcoR I和Not I双酶切鉴定阳性克隆。阳性重组子保存在含有20％甘油的LB中，冻于-80℃。重组质粒命名为pPIC9K-HSA-CP，阳性重组子命名为DH5α/pPIC9K-HSA-CP。

提取DH5α/pPIC9K-HSA-CP中的质粒，经SalI单酶切，DNA胶回收试剂盒回收后，电击转化毕赤酵母GS115，提取重组毕赤酵母基因组DNA，PCR扩增鉴定，阳性重组子命名为GS115/pPIC9K-HSA-CP。

(5)融合蛋白HSA-CP的表达

将GS115/pPIC9K-HSA-CP接种至装有10mL BMGY的50mL三角瓶中，250rpm，30℃培养24小时，离心收集菌体，将收集到的菌体重悬于3mL BMMY中，于50mL三角瓶中，250rpm，30℃继续培养，每24小时补加一次甲醇至终浓度1％，诱导3天，离心收集发酵液上清，进行SDS-PAGE验证，Western杂交鉴定融合蛋白HSA-CP分子的CP及HSA免疫源性。