[发明专利]人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白及其制备

说明书

技术领域

人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白的制备方法及产品，属于长效融合蛋白药物技术领域。

背景技术

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是血浆中的主要蛋白成分，在血浆中的浓度为40mg/mL(Phillip P.Minghettis et al.，THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，1986 261：6747-6757)，它除了具有维持血浆渗透压功能外，还能结合内源性和/或外源性配体，包括激素、有毒代谢产物、药物等。通过结合这些配体，HSA可以调节激素活性、内源性和/或外源性物质的毒性和药物的利用度(Ji-Sook Ha et al.，Biochimica et Biophysica Acta，20031640：119-128)。David S.Park等构建的Half HSA(截取HSA的前297个氨基酸残基)具有野生型HSA相应区类似的二级结构，同时保留了野生型HSA结合甲状腺素和甲状腺素类似物的能力(David S.Park et al.，IUBMB Life，1999 48：169-174)，细胞中刚翻译出来的人血清白蛋白具有典型的pre-pro-protein结构，包括18个氨基酸残基的信号肽和6个氨基酸残基前肽的原肽。信号肽和前肽在转运和分泌的过程中被切除，成熟的HSA由585个氨基酸残基组成，含有17对二硫键，分子量约为66.5KDa。通常情况下，HSA为非糖基化蛋白，然而有的突变体中也存在N-连接糖基化(见Uniprot中的proteinALBU_HUMAN)。Peters的观点认为进化出大分子蛋白的优点是减小其在内循环时经肾排泄(Peters T.Jr.，Adv.Protein Chem.，1985 37：161-245)。HSA的分子量相对较大，在正常情况下，不易被肾小球滤过，其血浆半衰期在20天左右。

胰岛素C肽(C-Peptide，CP)是胰岛素原分子中连接胰岛素A链与B链的连接肽，由31个氨基酸组成，分子量为3020Da，是胰岛素原转变为胰岛素过程中的裂解产物，与胰岛素等分子从胰岛β细胞分泌。胰岛素C肽通过与细胞膜上G蛋白耦联的受体结合，使Ca²⁺通道开放，激活Na⁺-K⁺-ATP酶活性和一氧化氮合酶的活性，扩张血管，增加血流量，改善红细胞变形能力，减少肾小球尿白蛋白的排泄量增加神经传导速率，从而改善糖尿病患者的肾脏、神经、微血管病变，使胰岛素C肽在糖尿病并发症中的潜在作用价值越来越受到广泛重视。正常人基础血浆胰岛素C肽水平约为0.4nmol/L，半衰期为20min，这些特性给胰岛素C肽的药物化进展造成了很大的障碍，研究胰岛素C肽的药物化，首先要改善它的稳定性，提高其生物利用度。为了克服上述缺点，可以对胰岛素C肽加以修饰，以延长其半衰期。主要方法有做成缓释剂型、利用化学手段修饰(如用PEG，葡聚糖修饰)、利用基因工程手段将其与其它大分子蛋白融合。本发明将把胰岛素C肽和HSA进行融合表达，通过研发人胰岛素C肽的长效化技术，改善胰岛素C肽体内药代动力学性状，研发出一种具有自主知识产权的长效新药。

发明内容

本发明的目的是提供一种人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白的制备方法及产品。本发明的融合蛋白在保持了人胰岛素C肽的生理特性的基础上延长其在体内的半衰期，在药学领域有良好的应用前景。

本发明的技术方案：人工合成CP cDNA；通过PCR从人胎肝cDNA文库中扩增获得HSA cDNA；利用同框酶切连接原理，连接HSA cDNA和CP cDNA，中间不加入任何连接肽，得到的HSA-CP cDNA融合基因插入到克隆载体pBlu2KSP中保存；HSA-CP cDNA融合基因被整合到宿主的染色体中，在宿主细胞中进行表达。

CP cDNA的克隆，HSA cDNA的克隆，含HSA cDNA和CP cDNA融合基因的克隆载体的构建，融合蛋白HSA-CP的重组酵母构建和融合蛋白HSA-CP的表达的步骤详见实施例。

用上述方法制备的人血清白蛋白与人胰岛素C肽的融合蛋白，包括与人血清白蛋白至少85％序列同源的第一区或人血清白蛋白的部分氨基酸序列的第一区和与人胰岛素C肽至少85％序列同源的第二区；所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的N末端，所述与人胰岛素C肽同源的第二区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽；或所述与人胰岛素C肽同源的第二区位于融合蛋白的N末端，所述与人血清白蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C末端，中间不加任何连接肽。