[发明专利]家蚕丝腺生物工厂的建立方法及其制药用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种家蚕丝腺工厂的建立方法及其在多肽类药物制备领域的用途。

背景技术

生物学和分子生物学研究领域的成就促进了转基因动物生物反应器的蓬勃发展。转基因动物生产的蛋白经过后加工而类似人体天然蛋白的结构，有完全相似的生物活性，用转基因动物生物反应器生产药用蛋白是生物技术领域里的又一次革命，它以一个全新生产珍贵药用蛋白的模式区别于传统药物的生产。

转基因动物生物反应器生产药用蛋白的一种技术路线是，将目的基因构建成载体，通过不同方法获得转基因动物，通过转基因动物的特定器官收集并提纯药用蛋白，目前以乳腺生物反应器较为多见，已成功地在转基因动物的乳腺生物反应器中表达了多种蛋白基因。

家蚕是一个理想的生物反应器，具有表达水平高、翻译后加工与修饰、安全性高、成本低廉等优势，已经成为某些真核生物所不可替代的表达系统。家蚕丝腺是典型的外分泌腺体。它是由功能高度特化为合成、分泌丝蛋白的巨核细胞所构成的单层细胞管壁的管状器官。丝腺合成并分泌到丝腺腔里的蛋白共两类，即丝素蛋白与丝胶蛋白。丝素蛋白在后部丝腺合成，有重链、轻链和P25三种蛋白分子以6∶6∶1的比例构成，难溶于水(Cong-Zhao Zhou，et al.NucleicAcids Reasearch，2000，28(12)：2413-2419；Inoue S，et al.J Biol Chem，2000，275(51)：40517-28)。由于丝腺具有强大的生产蛋白质和分泌蛋白质的能力，而且丝腺腔中只含有丝素蛋白和丝胶蛋白，其性质比较特殊，很容易与其他目的蛋白质分开，将对后分离纯化带来极大方便，这一优点将是已有的表达系统所不及的。因此，利用家蚕丝腺生物工厂(生物反应器)生产外源高价值蛋白具有实用经济效益和广阔的发展前景。

公开号为CN1786176的中国专利《家蚕丝腺生物反应器及其构建方法》公开了一种家蚕丝胶-1基因启动子及信号肽编码区带动的家蚕丝腺生物反应器，通过构建由含有丝胶-1基因启动子及信号肽编码区的DNA片段、外源目的基因、含有丝胶-1基因polyA信号位点序列的表达框构成的丝腺特异分泌表达质粒，再将表达框架亚克隆进病毒表达系统的供体质粒，然后转化DH10BacΔEGT感受态细胞，抽提重组病毒DNA，导入载体细胞包装成重组病毒质粒，大量扩增病毒，最后注射家蚕，当病毒在蚕体大量繁殖，复制的时候，外源基因在启动子的控制下得到表达和后加工。

上述现有技术的特点是利用昆虫病毒表达系统表达外源基因，该系统的缺点是存在病毒的潜在危害。

公开号为CN1912116的中国专利，利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋白的方法公开了一种利用家蚕丝心蛋白重链启动子大量表达外源蛋白的方法，以piggyBac的衍生载体pBac[3xp3-DsRedaf]为转座子，构建携带IGF-I基因且可进行表达的重组注射载体pBac[3XP3-DsRedaf]-R3，经QIAGEN Plasmid Midikit(Qiagen)试剂盒纯化，与pHA3PIG(Tamura et al.，2000)辅助质粒一起，采用Kanda & Tamura(1991)描述的方法进行家蚕胚胎显微注射。注射后的蚕卵用无毒胶封口，催青孵化，将当代的蚕蛾进行自交或回交，获得G1代蚕卵，扫描G1代蚕卵获得转基因个体。

该专利所公开的方法中没有使用病毒表达系统，所以不存在杆状病毒可能带来的问题。

piggyBAC因子又称IFP2，是目前应用比较广泛的昆虫转座子，已被证实在多种昆虫中可以发挥转座作用，可以通过转座而将外源基因重组整合到昆虫基因组中。

通常情况下，通过抗生素压力筛选可以获得稳定表达外源基因的转基因个体。运用G418筛选哺乳动物转化细胞已有较多的报道，而通过稳定转化的昆虫细胞表达外源基因的报道还不多见，而通过G418筛选转基因家蚕个体研究更少。最近，Invitrogen公司开发了一种能在昆虫sf细胞稳定表达外源基因的载体pIZT/V5-His，该载体通过Zeocin的抗性标记筛选可获得稳定表达外源基因的细胞系，而通过Zeocin抗生素对转基因家蚕的筛选方法也未见报道。

鉴于家蚕丝腺生物工厂(生物反应器)生产外源高价值蛋白具有实用经济效益和广阔的发展前景，研发一种家蚕丝腺生物工厂的建立方法具有重要的意义。

发明内容