[发明专利]运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法

权利要求书

1.一种运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)制备标准品的DNA模板，进行PCR扩增，回收扩增产物，测序，获得具有如表SEQ ID NO：1所示序列的基因，根据所述基因和引物序列设计并合成TaqMan探针，制备标准品质粒；

所述引物序列为：

引物序列一5’-CCACATGCAGTCGGTGTGAA-3；

引物序列二5’-GTTTGCCTACCGGTTGTTTACG-3’；

所述探针序列为：

5’FAM-TCATGTCTTGGCTATTGTAGACGTATCTGA-TAMRA3’；

(2)制备待测样品的DNA模板；

(3)对待测样品DNA模板进行荧光PCR检测；

(4)对标准品质粒进行荧光PCR检测，与步骤(3)结果进行阳性对照，得到检测结果。

2.根据权利要求1所述运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法，其特征在于步骤(1)所述PCR扩增条件为：(1)94℃，3分钟；(2)30个循环，其中每个循环包括94℃ 30秒、56℃ 30秒和72℃ 30秒三个步骤；(3)72℃ 5分钟。

3.根据权利要求1所述运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法，其特征在于步骤(3)或步骤(4)所述PCR检测的PCR反应体系中各组分构成比例如下：

成分         浓度        加样量

DNA样品                  1μL；

PCR buffer   10倍        1μL；

MgCl2        25mM        0.5μL；

dNTP         10mM        0.2μL；

引物序列一   20μmol/L   0.2μL；

引物序列二   20μmol/L   0.2μL；

探针序列     20μmol/L   0.1μL；

Taq酶        5U/μl      0.1μL；

双蒸水                   6.7μL；

总体积                   10μL；

其中DNA样品为标准品质粒或待测样品的DNA模板。

4.根据权利要求1所述运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法，其特征在于步骤(3)或步骤(4)所述PCR检测扩增程序为：

(1)94℃ 3分钟；

(2)94℃ 10秒；

(3)60℃ 30秒；

(4)回到程序(2)，重复45次。