[发明专利]运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学鉴定技术，具体地说涉及一种线虫分子生物学鉴定技术，即运用实时荧光PCR反应来鉴定粒线虫，特别是剪股颖粒线虫的技术。

背景技术

剪股颖粒线虫(Anguina agrostis)，是垫刃目(Tylenchida)、垫刃亚目(Tylenchina)、垫刃总科(Tylenchoidea)、粒线虫科(Anguinidae)、粒线虫属(Anguina)中一种重要的植物线虫，是牧草上重要的有害生物。其寄主植物主要包括剪股颖属(Agrostisspp.)、拂子茅属(Calamagrostis spp.)、苔草属(Carex spp.)、鸭茅属(Dactylis spp.)、画眉草属(Eragrostis spp.)、羊茅属(Festuca spp.)、大麦属(Hordeum spp.)、黑麦草属(Lolium spp.)、梯牧草属(Phleum spp.)、早熟禾属(Poa spp.)、碱茅属(Puccinelliaspp.)、鼠尾粟属(Sporobolus spp.)、三毛草属(Trisetum spp.)等，主要为害寄主植物的花序，致使病株的种子和地上部产量下降。特别是在广泛种植剪股颖等牧草的地区，对生产构成严重的威胁。此外，剪股颖粒线虫还是拉氏杆菌的介体，它们协同作用在寄主颖果上形成的黄色虫瘿对动物有高度毒性，可导致牛、马、羊等动物的神经紊乱，动物误食后中毒，甚至晕倒，最后抽搐死亡。

剪股颖粒线虫经我国专家进行风险分析后认为是危害十分严重的线虫，被列为中国进境植物检疫性线虫。1997年国家动植物检疫局发布了《关于对剪股颖粒线虫实施检疫措施的通知》，要求我国各进出境口岸加强对进境植物种子的审批和检疫。此后，我国深圳、广州、天津等口岸多次从进境草籽中截获剪股颖粒线虫，对整批货物进行了退货处理，引起了国内外贸易商及检验检疫部门的高度关注。美国等国家的动植物检疫部门要求出口商避免将含有剪股颖粒线虫的草籽输往中国。

鉴定剪股颖粒线虫是我国出入境检验检疫的一项重要工作，但是目前我国尚没有剪股颖粒线虫鉴定的标准方法，传统的形态学和形态测量学鉴定方法是主要基于线虫成虫的形态学特征和形体测量数据，鉴定时间较长；且只有发现成虫时，并结合寄主植物、分布区域等因素才能准确鉴定，但是日常口岸进出口草籽检疫中通常只能发现剪股颖粒线虫的幼虫，因此准确鉴定剪股颖粒线虫非常困难。国内研究的PCR扩增测序法以及本实验室研究的PCR-RFLP法、多重PCR法，虽然也可以准确鉴定剪股颖粒线虫，但是上述两种方法都要有PCR扩增、凝胶电泳和凝胶成像过程，程序复杂，鉴定时间较长。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，为解决快速鉴定剪股颖粒线虫的标准方法的问题而提供了一种运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法。

本发明的技术方案是提供一种运用实时荧光PCR技术鉴定剪股颖粒线虫的方法，包括以下步骤：

(1)设计并合成TaqMan探针序列，制备标准品质粒；

(2)制备待测样品的DNA模板；

(3)对待测样品DNA模板进行荧光PCR检测；

(4)对标准品质粒进行荧光PCR检测，与步骤(3)结果进行阳性对照，得到检测结果。

步骤(1)所述设计并合成TaqMan探针序列包括以下步骤：

A、制备标准品的DNA模板；

B、进行PCR扩增，回收扩增产物，测序，根据扩增后基因序列和引物序列设计并合成TaqMan探针。

步骤B所述PCR扩增条件为：(1)94℃，3分钟；(2)30个循环，其中每个循环包括94℃30秒、56℃30秒和72℃30秒三个步骤；(3)72℃5分钟。

步骤B所述扩增后基因序列如SEQ ID NO：1所示，即

gtttgcctac cggttgttta cggccgtctt atcatgtctt ggctattgtagacgtatctg atggctgttt tcacaccgac tgcatgtgg

步骤B所述引物序列为：

引物序列一5’-CCACATGCAGTCGGTGTGAA-3；

引物序列二5’-GTTTGCCTACCGGTTGTTTACG-3’。

步骤B所述探针序列为：

5’FAM-TCATGTCTTGGCTATTGTAGACGTATCTGA-TAMRA3’。

步骤(3)或步骤(4)所述PCR检测的PCR反应体系中各组分构成比例如下：

成分          浓度         加样量