[发明专利]化学发光免疫分析检测HLA-G超敏感方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学临床免疫分析领域。利用化学发光免疫分析通过检测HLA-G建立早期、敏感、广谱诊断恶性肿瘤的方法。此外本发明也可用于生理、病理、药理、免疫、生殖、肿瘤、器官移植等多方面研究。

技术背景

肿瘤是一种常见病和多发病，发病率居第二位。据世界卫生组织1997年报告称全球肿瘤患者每年死亡人数高达660万，到2020年全球的肿瘤患者将达到1500万。各种恶性肿瘤严重地威胁着人类的身体健康。在肿瘤发病的早期往往没有自觉症状，一旦发觉自觉症状时已到无法治疗的中晚期。在肿瘤发病机理和治疗问题尚未彻底解决的今天要降低肿瘤患者死亡率必须开展基层肿瘤普查工作，做到早发现早治疗。

尽管研究人员已经发现了多种肿瘤相关抗原，例如AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、CA15-3、CA19-9、CA50、CA125、PSA等等。由于免疫分析具有高度的特异性、专一性，所以利用某种肿瘤相关抗原只能检测其对应的一类肿瘤。如果要检查体内是否存在常见的某些肿瘤必须作多项检查。

1987年Geraghty等(1)发现并克隆了HLA-G。HLA-G是人类白细胞抗原(HLA)I组中非经典的组织相容性抗原。在正常组织中不存在。HLA-G最初发现于胎盘绒毛细胞滋养层。初期有关HLA-G的研究集中于胎儿同母亲之间的免疫耐受(2)。由于胎盘分泌HLA-G使母体产生免疫耐受，从而使胎儿避免了母体的排斥作用。近20年，HLA-G已成为重要的免疫分子，在免疫、生殖、肿瘤、器官移植等方面作为一种免疫抑制剂发挥着重要作用(3)。由于恶性肿瘤细胞能够表达和分泌HLA-G，恶性肿瘤才得以逃避人体免疫监视，使其快速生长和扩散。免疫组化检测结果证实在喉癌、食道癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌等多种恶性肿瘤组织中都能表达HLA-G。

大量的实验证明，HLA-G是一个具有高度肿瘤特异性的肿瘤标志物，在恶性肿瘤的表达具有普遍性。在肿瘤发生和发展过程中其水平在血液、其它体液及肿瘤组织中增高。因此检测HLA-G能广泛地应用于各种常见恶性肿瘤的诊断。通过检测HLA-G便可探明受检者体内是否存在常见的各种恶性肿瘤。因此我们有理由称HLA-G为“肿瘤共同抗原”。

由于HLA-G是肿瘤共同抗原，所以通过检测HLA-G可以诊断多种恶性肿瘤。目前已有检测HLA-G的免疫组化试剂盒和ELISA试剂盒的报道。由于ELISA检测HLA-G的敏感度比较低，不适合用于检测早期恶性肿瘤。为了检测早期恶性肿瘤所产生的低浓度HLA-G，我们建立了超敏感的化学发光免疫分析检测HLA-G的方法。用化学发光免疫分析技术检测HLA-G的试剂盒我们称之为“早期广谱肿瘤诊断试剂盒”。利用该试剂盒只作一次测试就可以诊断多种早期恶性肿瘤。

1977年Arakawe创建了化学发光免疫分析(Chemiluminescentimmunoassay，CLIA)。该方法可以使检测敏感度可达10的负18次方摩尔水平。根据标记物的不同，化学发光免疫分析可分以下三个类型：(1)以辣根过氧化物酶(HRP)为标记物的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为二酰基肼的衍生物，在氧化剂存在下，HRP催化二酰基肼衍生物发光，波长425nm。苯酚类化合物可增强其发光强度。(2)以碱性磷酸酶为标记物的酶促化学发光系统。该系统的发光底物为1，2-二氧环乙烷衍生物(或称金刚烷衍生物)。例如AMPPD、CSPD、CDP-Star、Lumi-phos480、Lumiphos-530等。荧光素衍生物和表面活性剂会增强并延长其发光强度，发光波长470nm。(3)以吖啶酯类化合物为标记物的化学发光系统。该系统不需酶催化，不需增强剂。吖啶酯类化合物在碱性H2O2作用下直接发光，波长430nm。吖啶酯类化合物发光系统发光强度高，反应干扰因素少，背景发光低，信噪比高，具有较高的灵敏度。吖啶酯类发光系统是一类很有效的化学发光系统。

参考文献：

1、Geraghty DE，Koller BH，Orr HT.A human major histocompatibilitycomplex class I gene that encodes a protein with a shortenedcytoplasmic segment.Proc Natl Acad Sci USA 1987；84：9145-9149.