[发明专利]水产品中致病菌多重PCR快速检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1、一种水产品中致病菌多重PCR快速检测试剂盒，其特征在于包括：10×PCRbuffer，1.0～3.0mmol/L MgCl₂，240μmol/L dNTP each，60～200nmol/L沙门氏菌引物，60～200nmol/L副溶血性弧菌引物，200nmol/L单核增生李斯特氏菌引物，1.3～3.0U Taq酶。

2、如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的沙门氏菌引物序列为上游：5’-ATC GGC GTT ATC CCT TTC TCT GGT G-3’；下游：5’-ATG TTG TCCTGC CCC TGG TAA GAG A-3’。

3、如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的副溶血性弧菌引物序列为上游：5’-GTC TTC TGA CGC AAT CGT TG-3’；下游：5’-ATA CGA GTG GTTGCT GTC ATG-3’。

4、如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的单核增生李斯特氏菌引物序列为上游：5’-CAA ACT GCT AAC ACA GCT ACT-3’；下游：5’-TTA TAC GCGACC GAA GCC AAC-3’。

5、一种使用如权利要求1或2或3或4所述的检测试剂盒同时检测水产品中沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的多重PCR检测方法，其特征在于包括提取样品DNA，多重PCR扩增，扩增后的产物进行电泳检测，分析结果。

6、如权利要求5所述的检测方法，其特征在于在提取DNA之前，对样品进行沙门氏菌、副溶血性弧菌和单核细胞增生性李斯特氏菌的富集培养。

7、如权利要求6所述的检测方法，其特征在于在富集培养中，培养基为含2％质量含量的NaCl的脑心浸液肉汤。

8、如权利要求5或6或7所述的检测方法，其特征在于样品DNA提取包括：1)1.5mL样品，10000r/min离心10min，去上清液；2)加567μL TE悬浮沉淀，加50g/L溶菌酶10μL 37℃保温1h，再加30μL100g/L SDS，3μL 20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃保温1h；3)加100μL 5mol/L NaCl，混匀；4)加80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min；5)用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇，其体积比为25∶24∶1，抽提，10000r/min离心10min，将上层清液移至干净离心管；6)用等体积氯仿∶异戊醇，其体积比为24∶1，抽提，取上清液移至干净离心管中；7)加等体积异丙醇，颠倒混合，室温下静置30min，沉淀DNA；8)用玻棒捞出DNA沉淀，70％乙醇漂洗后，吸干，溶解于100μLTE，-20℃保存。

9、如权利要求5或6或7所述的检测方法，其特征在于多重PCR扩增包括：1)多重PCR扩增反应体系：10×PCR buffer 2.5μL，2mmol/L MgCl₂，240μmol/L dNTP each，引物浓度分别为：单核增生李斯特氏菌引物200nmol/L，沙门氏菌、副溶血性弧菌引物各60～200nmol/L，3U Taq酶，DNA模板2μL，反应体系25μL；2)扩增反应条件：94℃预变性5min；94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸2min，共进行35个循环；72℃延伸10min；于4℃下保存。

10、如权利要求5或6或7所述的检测方法，其特征在于扩增产物电泳检测包括：将扩增产物于15g/L琼脂糖凝胶电泳检测及UV I凝胶成像系统分析结果。