[发明专利]水产品中致病菌多重PCR快速检测试剂盒及检测方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种微生物检测装置及检测方法。

【背景技术】

我国是一个水产大国，随着社会发展和人们对健康的关注以及国际贸易需要，水产品安全问题倍受关注，水产品安全问题直接影响渔业经济发展乃至水产品国际贸易。由于水产品营养丰富，因而极易受到各种微生物的污染，沙门氏菌(Salmonella spp.)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是常见的引起水产品污染的重要致病菌，在我国现行国家卫生标准中，这3种菌被列为无公害水产品不得检出的致病菌。目前，包括我国在内的许多国家对这些致病菌的检验大多仍沿用传统的细菌培养及生化鉴定方法，其检测周期长、操作繁琐、灵敏度低，而且每次只能检测出一种致病菌，面对日益增加的多重混合污染，目前的实验诊断方法显得严重滞后。因此，国内外学者都致力于建立分子生物学的鉴定方法。

由于多重PCR技术可以在一个反应管中同时检测多种病原微生物，具有高效、低成本、速度快等优点，一经提出，即得到众多研究者的青睐，目前已在病原微生物的检测中得到了广泛应用。选择特异的靶基因和设计出合理的引物对PCR检测致病菌至关重要。沙门氏菌的侵袭蛋白决定细菌进入宿主上皮细胞的能力，与沙门氏菌的致病性密切相关，它是由invA、invB、invC、invD和invE等一组基因编码，其中invA为沙门氏菌的主要毒力因子(ZhaoS，Qaiyumi S，Friedman S，et al.Characterization of Salmonella enterica Serotype newport isolated from humans and food animals.J ClinMicrobiol，2003，41(12)：5366-5371.)。研究证明沙门氏菌的invA基因序列比较保守，可以作为PCR检测沙门氏菌的靶基因(Cohen ND.Neibergs HL.Megruder ED，et al.Genus-specific detection of salmonellae using the polymerase chain reaction.J Vet Diagn Invest，1993，5(3)：368-371.)。副溶血性弧菌的PCR检测方法中，多以其毒力基因tdh和trh为靶基因，但后来研究发现某些不含这两种毒力基因的副溶血性弧菌菌株也具有致病性(Osawa R，Arakawa E.Genotyping of pandemic Vibrio parahaemolyticus O3:K6 still open to quention.J Clin Microbiol，2002，40(7)：2708-2709.)。本文选取toxR作为检测副溶血性弧菌的靶基因，toxR基因在弧菌属中具有高度的保守性，实验证明副溶血性弧菌的toxR基因与霍乱弧菌的toxR基因的同源性是52％，要比它们的rRNA基因的同源性92％低得多(Kita-Tsukamoto K，Oyaizu H，Nanba K，et al.Phylogenetic relationships ofmarine bacteria，mainly members of the family Vibrionaceae，determined on the basis of 16S rRNA sequences.Int J Syst Bacteriol，1993，43(1)：8-19.及Lin Z，Kumagai K，Baba K，et al.Vibrio parahaemolyticus has a homolog of the Vibrio cholerae toxRS operon that mediatesenvironmentally induced regulation of the thermostable direct hemolysin gene.J Bacteriol，1993，175(12)：3844-3855.)。单核细胞增生性李斯特氏菌的靶基因则采用编码主要胞外蛋白p60的iap基因，它是单核细胞增生性李斯特氏菌重要毒力因子(Bubert A，Hein I，Rauch M，et al.Detection and differentiation of Listeria spp.by a single reaction based on multiplex PCR.Appl Environ Microbiol，1999，65(10)：4688-4692.)。