[发明专利]脓毒症早期诊断液相芯片及其制备方法

权利要求书

1.一种脓毒症早期诊断液相芯片，其特征是，主要包括有：

1)包被微球：含有分别包被了降钙素原捕获抗体的微球，包被了C反应蛋白捕获抗体的微 球，包被了白细胞介素-6捕获抗体的微球，和包被了新喋呤捕获抗体的微球，上述微球分别 具有不同颜色编码；

2)生物素标记检测抗体：含有分别用生物素标记的降钙素原、C反应蛋白、白细胞介素-6及 新喋呤的检测抗体；

3)链亲和素藻红蛋白；

(1)每种相应的捕获抗体包被微球的制备如下：

-将50μL微球活化后，≥15000rpm，离心；

-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280μL 50mM的MES的溶液中，涡漩振荡30s， 超声处理1min，后将微球于≥15000rpm，离心；重复该步骤；

-吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡30s，超声 处理1min；

-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2μg抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积 补至450-550μL；

-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr；

-偶联了抗体后的微球以≥12000g的速度，离心8-12min；

-吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡30s，超声处理1min；

-室温避光振荡30min；再于≥12000g，离心8-12min；

-吸弃上清，将微球重悬于1mL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡30s，超声处理1min；微 球≥12000g，离心4-6min；重复该步骤一次；

-吸弃上清，将微球重悬于500-1000μL PBS-TBN溶液中；

-每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8℃避光单独保存，使用时，依据检 测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为110-140个/μl；

(2)每种检测抗体的生物素标记的制备如下：

-依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，视为目标体积；

-用DMSO溶解，配制10mg/ml的NHS-Biotin溶液；

-按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin溶液；

-加入体积为目标体积的1/10的pH8.9的NaHCO₃溶液；

-加入pH7.4的PBS补至目标体积；

-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为 800rpm-1000rpm；

-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin；

-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合，使每种检测抗体最终浓度 达到1-3μg/ml。

2.根据权利要求1所述的脓毒症早期诊断液相芯片，其特征是，每种包被捕获抗体的微球的 使用浓度为120个/μl；每种生物素标记检测抗体的使用浓度为2μg/ml。