[发明专利]基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法

权利要求书

1、一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于包括如下步骤：

一)提取待测样品的基因组DNA；

二)用基因分析软件对转基因样品基因组DNA序列中的限制性内切酶位点进行分析，根据分析结果选择出能够切割出包含转基因特征序列的目的DNA片段的两种限制性内切酶，该目的DNA片段中不含有这两种限制性内切酶的切割位点；用这两种限制性内切酶依次对样品基因组DNA进行酶切，得到酶切产物，酶切产物中含有包含转基因特征序列的目的DNA片段；

三)将步骤二)中得到的酶切产物与DNA Markers同时进行琼脂糖凝胶电泳；将目的DNA片段长度附近的凝胶切下，用DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收该长度的DNA片段；

四)用基因分析软件根据目的DNA片段序列设计并合成两段特异性DNA序列，所述特异性DNA序列只与目的DNA片段序列互补，而不与基因组中其它任何序列互补：其中，一段为生物素标记探针序列，制备成生物素标记探针；另一段为捕获探针序列，其一端修饰上与纳米/微米粒子连接的活性基团，制备成高效电化学发光探针；

五)将步骤四)制备的生物素标记探针和高效电化学发光探针分别与步骤三)中回收的包含有目的DNA片段的酶切产物进行杂交，控制温度90～95℃、2～10分钟，然后降温至45～70℃、20～120分钟；得到杂交产物；

六)将步骤五)所得杂交产物和链霉亲和素包被的磁珠在pH 7～8的PBS缓冲液或pH 7～8的TE缓冲液中进行孵育连接后，置于磁场中用上述缓冲液进行清洗、收集，随后，将收集到的连有杂交产物的磁珠转入检测样品池中；

七)向检测样品池中加入含有能够与三联吡啶钌即TBR产生电化学发光反应的物质的电化学发光分析液，给定电压1～1.5V，TBR与该物质发生电化学发光反应，产生光信号；检测光信号，并根据光信号值是否高于阈值，判断待测样品中是否含有转基因成分：如果光信号值高于阈值则表明该样品为转基因样品，即该样品中含有转基因成分。

2、根据权利要求1所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：在判断含有转基因成分的待测样品中进行如下定量分析：通过对不同转基因成分质量含量的标准样品进行电化学发光检测，制定出标准曲线；随后，即可根据标准曲线对步骤七)中确定的转基因样品中的转基因成分进行定量分析。

3、根据权利要求1所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤二)中包含转基因特征序列的目的DNA片段是包含CaMV35S启动子、NOS终止子、FMV35S启动子、NOS终止子、CaMV终止子或NptII终止子特征序列的目的DNA片段。

4、根据权利要求1或2或3所述的一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，其特征在于：所述步骤四)中高效电化学发光探针是按下述方法制备：

(1)设计一段与目的DNA片段不互补的寡核苷酸链，在其一端修饰上可与纳米/微米粒子连接的活性基团，另一端修饰上氨基基团；将该寡核苷酸链与过量的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯即TBR-NHS ester在碱性条件下10～60℃避光孵育2小时以上，使氨基基团和TBR-NHS ester进行连接反应，得到TBR-寡核苷酸链；随后，用70％～100％乙醇洗涤并沉淀该寡核苷酸链；最后，用纯水或pH 7～8的TE缓冲液溶解TBR-寡核苷酸链；

(2)TBR-寡核苷酸链和捕获探针以大于40∶1的摩尔比混匀；随后，利用TBR-寡核苷酸链和捕获探针上的可与纳米/微米粒子连接的活性基团与纳米/微米粒子反应，将TBR-寡核苷酸链和捕获探针修饰到纳米/微米粒子表面，制备得到高效电化学发光探针。