[发明专利]基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种非PCR扩增的转基因产品(GMO)检测方法，特别涉及一种基于纳米/微米粒子放大信号的快速检测GMO的电化学发光(ECL)方法。

背景技术

综合目前世界各国的GMO检测技术，根据检测物不同，主要分为蛋白质检测、RNA检测和DNA检测三种类型。对于蛋白质的检测主要是采用血清学方法，由于有些GMO不表达蛋白质或表达量不稳定，还有的基因表达具有组织特异性，因此血清学检测方法仅限于个别GMO的检测；此外，由于蛋白质容易热变性，所以很难检测用转基因原料加工而成的食品，具有一定的局限性。RNA检测则由于受到RNA容易降解和对实验技术条件要求较高的限制而较难普及。而DNA是相当稳定的分子，适合多数种类样品(原材料、食品配方组成成分、加工产品)的检测，因此，DNA检测法是目前最主要的GMO检测法，它通过检测样品中是否含有外源基因成分——一般包括启动子、报告基因、目的基因和终止子(其中启动子和终止子为表达目的基因所必需)，来判断样品中是否含有转基因成分。目前，转基因植物所采用的启动子主要为来源于花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子、根瘤农杆菌的NOS启动子及玄参花叶病毒的FMV35S启动子；广泛应用的终止子分别来源于根瘤农杆菌的NOS终止子、花椰菜花叶病毒的CaMV终止子以及新霉素磷酸转移酶NptII终止子。针对上述基因的检测可涵盖95％的现有的转基因植物检测的需要。

在DNA检测法中，基于PCR扩增的检测方法是目前最主要的GMO检测手段。尽管PCR方法是高灵敏度的DNA水平检测，但常伴有各种假性结果出现：一方面，DNA提取时产生的各种反应抑制因子，可能使PCR呈假阴性；另一方面，PCR过程中容易引入非特异性扩增，从而使PCR呈假阳性。此外，PCR操作复杂、检测时间长、成本高，还容易造成定量不准确等一系列问题。因此，发展一种非PCR扩增的快速GMO检测方法是很多科学家追求的目标。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测GMO的ECL方法，它包括对绝大多数GMO基因组DNA中含有的包括转基因特征序列(如CaMV 35S启动子、NOS终止子、FMV35S启动子、NOS终止子、CaMV终止子以及NptII终止子等)的目的DNA片段进行酶切；与生物素标记探针杂交以筛选目的DNA片段；高效ECL探针的制备及其与目的DNA片段进行杂交；进行ECL检测并根据光信号值是否高于阈值判断样品中是否含有转基因成分；以及根据标准曲线对转基因样品中的转基因成分进行定量分析等内容。

本发明的目的通过下述技术方案实现：基于纳米/微米粒子放大信号的非PCR扩增的快速检测转基因产品的电化学发光方法，具体包括如下步骤：

一)提取待测样品的基因组DNA。

二)用基因分析软件(如Primer 5.0)对转基因样品基因组DNA序列中的限制性内切酶位点进行分析，根据分析结果选择出能够切割出包含转基因特征序列的目的DNA片段的两种限制性内切酶，该目的DNA片段中不含有这两种限制性内切酶的切割位点；用这两种限制性内切酶依次对样品基因组DNA进行酶切，得到酶切产物，酶切产物中含有包含转基因特征序列的目的DNA片段。

三)将步骤二)中得到的酶切产物与DNA Markers(DNA分子量标准)同时进行琼脂糖凝胶电泳；将目的DNA片段长度附近的凝胶切下，用DNA凝胶回收试剂盒纯化、回收该长度的DNA片段。

四)用基因分析软件(如Primer 5.0)根据目的DNA片段序列设计并合成两段特异性DNA序列(该特异性DNA序列只与目的DNA片段序列互补，而不与基因组DNA中其它任何序列互补)：其中，一段为生物素标记探针序列，制备成生物素标记探针；另一段为捕获探针序列，其一端修饰上可与纳米/微米粒子连接的活性基团，制备成高效ECL探针。

五)将步骤四)制备的生物素标记探针和高效ECL探针分别与步骤三)中回收的包含有目的DNA片段的酶切产物进行杂交，控制温度90～95℃、2～10分钟，然后降温至45～70℃、20～120分钟；得到杂交产物。

六)将步骤五)所得杂交产物和链霉亲和素包被的磁珠在PBS缓冲液(pH7～8)或TE(pH 7～8)缓冲液中进行连接后，置于磁场中用上述缓冲液进行清洗、收集，随后，将收集到的连有杂交产物的磁珠转入检测样品池中。