[发明专利]基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法

权利要求书

1、一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)从转基因物种样品中提取样品的基因组DNA即靶基因1；

(2)将靶基因1与过量的靶基因探针2混合，90～95℃变性，然后自然冷却到室温，靶基因1与靶基因探针2退火、杂交；

(3)然后加入2～5个单位DNA连接酶，37℃下进行连接反应20～30分钟，靶基因探针2被DNA连接酶连接成环化探针3；

(4)在上述环化探针3中加入过量的与环化探针3互补的生物素化的复制引物4、10～15个单位DNA聚合酶和1～3毫摩尔dNTPs，在37℃进行滚环扩增复制反应90分钟，产生生物素化滚环扩增产物5；

(5)在室温下，将步骤(4)得到的生物素化滚环扩增产物5与过量的钌标记的核酸探针6杂交30～60分钟，得到杂交产物；

(6)将上述杂交产物与链霉亲和素包被的磁珠孵育20～30分钟，然后用磁分离器分离，去掉上清，收集磁珠吸附的杂交产物于电化学发光仪器检测样品池中；

(7)往检测样品池中加入三丙胺或二丁基乙醇胺，检测样品池中的三联吡啶钌复合物产生的电化学发光信号确定样品中是否含有转基因产品；

所述步骤(2)的靶基因探针2是一段线性单链DNA探针，其长度为50～200个碱基长度，每条探针有一个5’磷酸末端和一个3’羟基末端；靶基因探针2包括两个部分，分别为位于5’端和3’端的目标基因杂交区，以及位于5’端和3’端的目标基因杂交区中的填充区，所述杂交区的序列与靶基因1完全互补；

所述步骤(4)的生物素化的复制引物4是一段5’端标记上生物素的DNA单链，其长度为15～30个碱基长度，它的序列与环化探针3的填充区互补；

所述步骤(5)钌标记的核酸探针6为标记上钌的核酸探针，其长度为15～30个碱基长度，其序列与生物素化滚环扩增产物5的重复序列互补。

2、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于：所述步骤(1)的靶基因1的提取方法如下：对非粉末状的固体转基因物种样品，采用研磨处理成粉末状，然后提取样品中的DNA；对于液态转基因物种样品，采用冷冻干燥法干燥并磨碎成粉末状。

3、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于：所述步骤(1)的靶基因1为含有CAMV 35S启动子、NOS终止子、抗卡那霉素基因、抗新霉素基因、抗潮霉素基因或抗草丁膦基因的基因。

4、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于：当转基因物种样品中含有CAMV 35S启动子时，所述靶基因探针2为：5’TGG CCT TTC CTT TAT CGC AAT CCA GTT AGA ATG AAG ATA GCGCAT GAG GTG TTA CGT ACG GCA GAG GCA TCT TCA ACG A3’。

5、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于：所述步骤(3)的DNA连接酶包括E.coli DNA连接酶、T4 DNA连接酶或Taq DNA连接酶。

6、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于：当转基因物种样品中含有CAMV 35S启动子时，所述生物素化的复制引物4为：5’biotin-TTTTTT AGCGCTATCTTCA3’。

7、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于：所述步骤(4)的DNA聚合酶包括大肠杆菌DNA聚合酶、噬菌体M2DNA聚合酶、T5DNA聚合酶、PRD1DNA聚合酶或者Phi29DNA聚合酶。

8、根据权利要求1所述的一种基于滚环扩增技术检测转基因物种的方法，其特征在于：当转基因物种样品中含有CAMV 35S启动子时，所述步骤(5)中钌标记的核酸探针6为5’AAT CCA GTTAGAATGAAG 3’。